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https://ri.ufs.br/jspui/handle/riufs/17128
Tipo de Documento: | Dissertação |
Título : | Padronização e validação de um teste imunoenzimático quantitativo anti-SARS-CoV-2 |
Otros títulos : | Standardization and validation of a quantitative anti-IgG immunoenzymatic test for SARS-CoV-2 |
Autor : | Silva, Danilo Nobre da |
Fecha de publicación : | 26-ago-2022 |
Director(a): | Lima, Dulce Marta Schimieguel Mascarenhas |
Co-Director(a): | Almeida, Carlos Arthur Cardoso |
Resumen: | Desde a declaração do vírus SARS-CoV-2 como responsável por causar a pandemia da COVID-19 em 2020, vários esforços foram iniciados e continuam sendo feitos para o controle, diagnóstico e manejo terapêutico. Testes imunocromatográficos e por imunofluorescência (FIA) foram desenvolvidos baseados na pesquisa qualitativa de anticorpos contra o SARS-CoV-2 e recomendados para investigar a prevalência da infecção. Porém, muitos deles apresentam baixa sensibilidade e especificidade. Entretanto, o teste sorológico quantitativo utilizado em diagnósticos de inúmeras infecções, o ensaio imunoenzimático (ELISA), apresenta alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade, podendo ser este um teste mais adequado para diagnóstico, acompanhamento da evolução da COVID-19 e resposta à imunização. O objetivo desse trabalho foi padronizar e validar um ensaio imunoenzimático quantitativo in house para diagnóstico e acompanhamento da COVID-19. Os testes iniciais foram realizados em amostras de pacientes com COVID-19 para padronização da técnica, e posterior validação. Primeiramente, foi realizada a padronização das etapas do ensaio imunoenzimático. Depois, foram determinados a curva padrão, o cut off, e realizados os testes para a validação do teste. Para as análises estatísticas foi considerado o nível de significância p<0,05. O cut off foi determinado pela média da concentração dos CN (3,59ng/mL) obtidos em março/2019, antes da COVID-19, mais dois desvios padrão. cut off=11,49ng/mL. Na validação, o ensaio apresentou 53% de sensibilidade e 94% de especificidade, comparado ao FIA. Avaliando-se que o kit FIA utilizado é um teste qualitativo, foi avaliada a precisão desse ensaio sorológico por apresentar um número elevado de falsos negativos entre as amostras estudadas e considerou-se a comparação com outro teste. Foi realizada outra análise com o teste de anticorpos neutralizantes anti-RBD-S1 e resultou em 94% de sensibilidade e 91% de especificidade. A proteína N recombinante foi selecionada neste trabalho por sua elevada antigenicidade e imunogenicidade, multipotencialidade funcional, relação com a patogênese viral, e que a maioria dos testes imunoenzimáticos atualmente comercializados baseiam-se em estudos com a proteína spike. O ensaio imunoenzimático indireto quantitativo anti-IgG para SARSCoV-2 in house é um teste tecnicamente simples e rápido, possui melhor rendimento e resultados de fácil leitura e interpretação. Contrariando a maioria dos testes sorológicos comerciais atualmente com metodologias qualitativas, este teste tem a vantagem de ser um teste quantitativo, fornecendo resultados mais robustos e com maior especificidade. A aplicação deste ensaio fornece informações importantes para o diagnóstico, manejo terapêutico e acompanhamento da recuperação dos pacientes com COVID-19 e consequentemente, para o planejamento do controle epidemiológico da doença. Dessa forma, o ensaio imunoenzimático quantitativo indireto foi padronizado e validado para a detecção de anticorpos IgG anti-SARSCoV-2, determinando, então, a concentração adequada do antígeno, as diluições do anticorpo primário e secundário, o cut off e a da curva padrão, gerando um novo teste de alta qualidade, alta sensibilidade, alta especificidade e de baixo custo. |
Resumen : | Since the declaration of the SARS-CoV-2 virus as responsible for causing the COVID-19 pandemic in 2020, several efforts have been initiated and continue to be made towards control, diagnosis and therapeutic management. Immunochromatographic and immunofluorescence (FIA) tests were developed based on the qualitative investigation of antibodies against SARS-CoV-2 and recommended to investigate the prevalence of the infection. However, many of them have low sensitivity and specificity. However, the quantitative serological test used in the diagnosis of numerous infections, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), has high sensitivity, specificity and reproducibility, which may be a more suitable test for diagnosis, monitoring of the evolution of COVID-19 and response to immunization. The objective of this work was to standardize and validate an in-house quantitative enzyme immunoassay for the diagnosis and follow-up of COVID-19. Initial tests were performed on samples from patients with COVID-19 to standardize the technique and later validate it. First, the standardization of the steps of the immunoenzymatic assay was carried out. Afterwards, the standard curve, the cut off, and the tests for the test validation were determined. For statistical analysis, the significance level of p<0.05 was considered. The cut off was determined by the mean concentration of CN (3.59ng/mL) obtained in March/2019, before COVID-19, plus two standard deviations. cut off=11.49ng/mL. At validation, the assay had 53% sensitivity and 94% specificity compared to FIA. Considering that the FIA kit used is a qualitative test, the precision of this serological assay was evaluated because it presented a high number of false negatives among the samples studied, and a comparison with another test was considered. Another analysis was performed with the anti-RBD-S1 neutralizing antibody test and resulted in 94% sensitivity and 91% specificity. Recombinant protein N was selected in this work for its high antigenicity and immunogenicity, functional multipotentiality, relationship with viral pathogenesis, and that most immunoenzymatic tests currently marketed are based on studies with the spike protein. The in-house quantitative indirect anti-IgG immunoenzymatic assay for SARS-CoV-2 is a technically simple and fast test, with better yield and results that are easy to read and interpret. Contrary to most commercial serological tests currently with qualitative methodologies, this test has the advantage of being a quantitative test, providing more robust results and with greater specificity. The application of this assay provides important information for the diagnosis, therapeutic management and monitoring of the recovery of patients with COVID-19 and, consequently, for planning the epidemiological control of the disease. Thus, the indirect quantitative enzyme immunoassay was standardized and validated for the detection of anti-SARS-CoV-2 IgG antibodies, then determining the adequate concentration of the antigen, the primary and secondary antibody dilutions, the cut off and the standard curve, generating a new test of high quality, high sensitivity, high specificity and low cost. |
Palabras clave : | COVID-19 SARS (Doença) Ensaio de imunoadsorção enzimática SARS-CoV-2 Proteína recombinante Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Recombinant protein |
Área CNPQ: | CIENCIAS BIOLOGICAS::FARMACOLOGIA |
Idioma : | por |
Institución: | Universidade Federal de Sergipe |
Programa de Posgrado: | Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas |
Citación : | SILVA, Danilo Nobre da. Padronização e validação de um teste imunoenzimático quantitativo anti-SARS-CoV-2. 2022. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, 2021. |
URI : | http://ri.ufs.br/jspui/handle/riufs/17128 |
Aparece en las colecciones: | Mestrado em Ciências Farmacêuticas |
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