UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM HETEROZIGOSE PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE DO RECEPTOR DO HORMÔNIO LIBERADOR DO GH ARACAJU 2014 ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM HETEROZIGOSE PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE DO RECEPTOR DO HORMÔNIO LIBERADOR DO GH Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe, como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar-Oliveira ARACAJU 2014 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE Pereira, Rossana Maria Cahino P436e Efeito da idade no fenótipo em heterozigose para mutação nula no gene do receptor do hormônio liberador do GH / Rossana Maria Cahino Pereira; orientador Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira. – Aracaju, 2014. 000 f. : il. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde - Núcleo de Pós- Graduação em Medicina), Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Universidade Federal de Sergipe, 2014. 1. Nanismo hipofisário. 2. Glândula pituitária - Doenças. 3. Mutação (Biologia). 4. Fenótipo. 5. Endocrinologia. I. Oliveira, Manuel Hermínio de Aguiar, orient. II. Título. CDU 616.432 ROSSANA MARIA CAHINO PEREIRA EFEITO DA IDADE NO FENÓTIPO EM HETEROZIGOSE PARA MUTAÇÃO NULA NO GENE DO RECEPTOR DO HORMÔNIO LIBERADOR DO GH Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe, como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde. APROVADA EM: ______ / ______ / _______ BANCA EXAMINADORA ________________________________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio Aguiar-Oliveira _________________________________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Marco Antônio Prado Nunes _________________________________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Joselina Luzia Menezes Oliveira ________________________________________________________________________ 3º Examinador: Prof. Dr. Francisco de Assis Pereira ______________________________________________________________________ 4ª Examinador: Prof. Dr. Carla Raquel Oliveira Simões PARECER ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar a DEUS e a TODA a ESPIRITUALIDADE que me acompanha em todos os momentos de minha vida, pois sei que NUNCA ESTOU SÓ! Aos meus pais de sangue Mário e Edna (sempre presentes), e meus pais do coração Eustáquio (sempre presente) e Naniza, pois tive o privilégio de ter dois pais amorosos e duas mães generosas exemplos a serem seguidos. Aos meus irmãos: Thiago, Sandra, Antônio Henrique, Ana Cristina, Simone e Naná obrigado por tudo! Aos Cunhados um abraço pelo apoio e incentivo. Aos meus pequenos sobrinhos: Júlia, Natália, Davi, Antônio Manuel, Sofia e Leonardo um beijo muito especial. Aos meus amigos, que estão sempre me apoiando e incentivando e sei que muito torceram para que este momento chegasse. Ao meu querido amigo Júnior Costa que está sempre disponível, apoiando e torcendo em todos os momentos, bem como todos que fazem parte da nossa Casa Espiritual. Aos colegas do Doutorado desejo que todos concluam sua caminhada. A equipe da “Pesquisa do Prof. Hermínio” todo meu carinho, pois cada participante é uma peça importante e todos juntos temos uma força que conseguimos romper barreiras e seguir em frente. Aos nossos “amigos e também pacientes” de Itabaianinha muito obrigada pela presteza que sempre atendem ao chamado da ciência colaborando com todas as nossas pesquisas mostrando que a confiança é recíproca. Universidade Federal de Sergipe, ao Núcleo de Pós Graduação em Medicina, aos Professores e amigos que lá fiz. As instituições de apoio, todas elas incentivadoras da ciência. Meu agradecimento especial a FAPITEC- Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe, onde por um tempo fui bolsista durante o doutorado. Aos professsores que participaram de minha qualificação, Drª Joselina, Dr Francisco e Drª Carla Raquel. Ao Dr Evandro Portes agradeço pela disponibilidade e também as oportunas sugestões que contribuiram para melhorar nosso trabalho. Ao Dr Marco Prado Nunes pela presteza em aceitar em participar de minha Banca de Doutorado quando houve a necessidade de substituição do Dr Evandro Portes. Meu muito obrigada, pois sem a sua presença não seria possível a realização de minha Defesa. Meu agradecimento especial vai para o Meu Orientador, o prof. Dr Manuel Hermínio, que para mim foi mais que um orientador, ele foi irmão, amigo, companheiro nesta jornada, que teve altos e baixos durante estes quatro anos. Sempre me incentivou mesmo quando eu estava totalmente sem estímulo e forças para seguir em frente. Sempre tinha uma palavra, algo que me acalmava e me fazia repensar tudo e assim seguir em frente. Se estou aqui neste momento devo muito ao Meu Mestre e Amigo. Ele sempre me inspira, sempre generoso, sempre atencioso, sempre positivo. "Trago no coração alguns medos, Uns quietos segredos, Um tanto de dor... Mas tanto de amor, Que se cala que abraça... Que delicadamente enlaça Cada esperança, cada sonho, cada sentimento. Que por todo momento me aninha... Enquanto o tempo caminha...” Cláudia Salles INSTITUIÇÕES DE APOIO: UFS- Universidade Federal de Sergipe JHSM- Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore – USA NIH- National Institute of Health CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPITEC- Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe ASCRIN- Associação do Crescimento Físico e Humano de Itabaianinha RESUMO Pereira, R.M.C. Efeito da idade no fenótipo em heterozigose para mutação nula no gene do receptor do hormônio liberador do GH. Tese de Doutorado em Ciências da Saúde. Núcleo de Pós-Graduação em Medicina. Universidade Federal de Sergipe. Aracaju-Sergipe, 2013. Várias doenças recessivas cursam com fenótipo em heterozigose. Em Itabaianinha, Sergipe, reside uma grande coorte com a mutação homozigótica c.57 +1 G>A no gene do receptor do GHRH (GHRHR) cursando com baixa estatura acentuada. Estudo prévio mostrou que os indivíduos heterozigotos adultos (MUT/N) para esta mutação apresentam altura, fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I) e percentual de massa gorda similares, mas redução de peso, do índice de massa corpórea (IMC) e da massa muscular (MM). Contudo apenas 10% destes tinham mais de 60 anos. Redução moderada na atividade do eixo GH-IGF- I pode ter um impacto maior no período de envelhecimento, quando a atividade deste eixo naturalmente diminui. Questionamos se a heterozigose para a referida mutação traduziria em um fenótipo parcial nos indivíduos idosos dessa coorte. Realizamos um estudo transversal em 843 indivíduos divididos em dois grupos (jovens, 20-40anos de idade, e idosos, 60-80 anos de idade) de indivíduos heterozigotos (MUT/N) e controles normais (N/N). A altura (cm), 2 peso (Kg), pressão arterial diastólica e sistólica (PAD e PAS mmHg) e o IMC (Kg/m ) foram analizados. Os dados foram expressos em média, desvio padrão e escore desvio padrão (EDP). O EDP do peso foi menor [0,13 (1,40) e -0,56 (1,80), p=0,03], e IMC apresentou uma tendência de redução [0,08 (1,40) e 0,33 (1,40), p=0,060] no grupo MUT/N jovem em comparação N/N jovem. O EDP da altura foi menor nos indivíduos MUT/N idosos em comparação aos N/N idosos [-2,79 (1,10) e -2,37(1,00), p=0,04], correspondendo a uma redução de 4,16 cm. Estes achados reforçam os dados anteriores de redução no peso e IMC em adultos jovens MUT/N e mostram redução na estatura em indivíduos idosos, sugerindo efeitos diferentes da heterozigose nos diferentes grupos etários. A redução da massa muscular já presente em adultos jovens, agravada pelo envelhecimento, pode contribuir para esta redução estatural. A mutação heterozigótica pode ser um fator contribuinte para fragilidade no idoso. Descritores: Receptor do GHRH; mutação; heterozigose; fenótipo. ABSTRACT Pereira, R.M.C. Effect of age on phenotype in heterozygous null mutation on in receptor gene in GH hormone releasing receptor gene. Doctoral thesis in Health Sciences, Nucleus of post graduation in Medicine. Federal University of Sergipe. Aracaju-Sergipe, 2013. Several recessive diseases present heterozygous phenotype. In Itabaianinha, Brazil, there is a big cohort with the homozygous mutation c.57 +1 G> A in the GHRH receptor (GHRHR) gene, leading to severe short stature. Previous study shows that heterozygous individuals (MUT/N) exhibit similar height, insulin like growth factor type 1 (IGF - I) and percentage of fat mass, but reduced weight, body mass index (BMI) and muscle mass. However, only 10 % of these were 60 or more years old. Moderate reduction in the GH/ IGF-I axis activity may have a greater impact on the aging period, when the activity of this axis naturally decreases. We question whether the study of heterozygosity for the mutation would result in a partial phenotype in the elderly cohort individuals. 843 individuals were analyzed in a cross sectional study by height, weight, systolic and diastolic blood pressure and BMI in two groups (young, 20-40 years of age) and old (60-80 years) of MUT/N individuals, and compared to a large number of individuals of normal genotype (N/N). SDS weight was lower [-0.13 (1.4) and - 0.56 (1.8), p=0.03], and BMI had a trend toward reduction [0.08 (1.40) and 0.33 (1.4), p=0.060] in young MUT/N in comparison to young N/N. SDS height was lower in older MUT/N individual vs. N/N [-2.79 (1.1) and -2.37(1.0), p=0.04], corresponding to a reduction of 4.16 cm. We conclude the previous data reduction in weight and BMI in young and show reduced stature in older MUT/N subjects, suggesting different effects of heterozygosis through the ages. The reduction of muscle mass already present at young age, aggravated by aging may contribute to this reduction in height. Heterozygous GHRHR mutations may be a factor contributing to frailty in elderly. Key words: GHRH receptor, mutation, heterozygosis, phenotype. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema da regulação intrínseca do eixo GH-IGF-I........................................ 19 Figura 2. Mutação homozigótica no sítio de “splicing” do íntron 1 no gene do receptor do hormônio liberador do hormônio do crescimento, ocorrendo troca de bases, Guanina (G) por Adenina (A) c.57+1G>A, WT (indivíduo normal – N/N), MUT (indivíduo mutado – MUT/MUT)...................................................................................... 21 Figura 3. Mapa da Região de Itabaianinha, Sergipe, Brasil............................................. 30 Figura 4. Equipe de alunos coletando dados..................................................................... 33 Figura 5. Apoio armado na Praça da Igreja Matriz para coleta de dados......................... 33 Figura 6. Professor Dr Manuel Hermínio solicitando a adesão da população durante a missa católica na Igreja Matriz da Imaculada Conceição de Itabaianinha........................ 34 Figura 7. Esquema representativo das bandas após DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) em indivíduos de Itabaianinha-SE. Indivíduos Homozigóticos normais (N/N) apresentaram uma única banda, indivíduos Homozigóticos afetados (MUT/MUT), uma única banda mais lenta e os Heterozigóticos (MUT/N), quatro bandas, a do alelo normal e a do alelo mutante e duas bandas mais lentas que representam heterodímeros gerados pelo anelamento das fitas anterior e posterior dos alelos de G (Guanina) e A (Adenina) durante amplificação do PCR............................................................................. 36 Figura 8. Representação gráfica da altura (cm), EDP da altura, peso (Kg) e EDP do peso nos indivíduos jovens (A) e idosos (B)....................................................................... 42 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Indicadores de Consumo de Álcool................................................................. 37 Tabela 2. Valores absolutos e escore desvio padrão (EDP) da altura, peso, índice de massa corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) média (Desvio padrão) por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos)............................................................................................................................... 38 Tabela 3. Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos)................................................... 39 Tabela 4. Valores absolutos e Escore desvio padrão (EDP) da Altura, Peso, Índice de Massa Corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) média (Desvio padrão) por genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos).................................................................................................................................. 40 Tabela 5. Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes por genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos)...................................................... 41 ABREVIATURAS A Adenina DGH Deficiência do Hormônio do Crescimento DIGH Deficiência Isolada do Hormônio do Crescimento DMO Densidade Mineral Óssea DMOv Densidade Mineral Óssea Volumétrica G Guanina GH Hormônio do Crescimento GH/IGF-I Eixo do Hormônio do Crescimento/Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 1 GHRH Hormônio Liberador do GH GHRHR Receptor do Hormônio Liberador do GH GHRHR Gene do Receptor do Hormônio Liberador do GH HDL Lipoproteína de alto peso molecular HOMAIR Modelo Homeostático do Índice de Resistência a Insulina IGFBPs Proteínas Carreadoras de IGF IGF-I Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 1 IGF-II Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 2 IGF-IR Receptor de IGF-I IGFs Fatores de Crescimento Semelhantes à Insulina IMC Índice de Massa Corpórea LDL Lipoproteína de Baixo Peso Molecular MG Massa Gorda % MG Percentagem de Massa Gorda MM Massa Muscular MUT/MUT Indivíduos Homozigóticos Afetados MUT/N Indivíduos Heterozigóticos N/N Indivíduos Homozigóticos Normais PAD Pressão Arterial Diastólica PAS Pressão Arterial Sistólica LISTA DE SÍMBOLOS < menor do que > maior do que  menor ou igual do que  maior ou igual do que % porcentagem  micro  beta cm centímetro m metro 2 m metro quadrado mg/dL miligrama/decilitro mg/L miligrama/litro mm milímetro mmHg milímetro de Mercúrio ng/mL nanograma/mililitro p probabilidade de significância Kg quilograma 2 Kg/m quilograma/metro quadrado SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 15 2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................... 18 2.1. Hormônio de crescimento (GH)........................................................................................ 18 2.2 Deficiência de GH.......................................................................................................... 19 2.3 Aspectos fenotípicos da mutação homozigótica no gene do GHRHR................................. 21 2.4 Relação entre GH, perfil ósseo, envelhecimento e longevidade......................................... 22 2.5 Fenótipo dos indivíduos heterozigotos............................................................................. 24 2.6 Envelhecimento e mudanças posturais no idoso.........................…..........………………….. 25 2.7 Justificativa................................................................................................................. 28 3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 29 4 CASUÍSTICA E MÉTODOS..................................................................................... 30 4.1 População do estudo...................................................................................................... 30 4.2 Critérios de inclusão...................................................................................................... 30 4.3 Tipo de estudo............................................................................................................... 31 4.4 Métodos ....................................................................................................................... 31 4.5 Análise Estatística....................................................................................................... 37 5 RESULTADOS............................................................................................................ 38 6 DISCUSSÃO................................................................................................................ 44 7 CONCLUSÕES............................................................................................................ 48 REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 49 ANEXO 1 Ofício ao TRE de Itabaianinha........................................................................... 57 ANEXO 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)......................................... 58 ANEXO 3 Entrevista ....................................................................................................... 66 ANEXO 4 Parecer do CEP e CONEP.................................................................................. 67 APÊNDICE 1 Artigo “Longevity in Untreated Congenital Growth Hormone Deficiency Due to a Homozygous Mutation in the GHRH Receptor Gene” ................... 69 APÊNDICE 2 Artigo “Old heterozygous individuals for a null GH releasing hormone receptor mutation loose more height that normal homozygous. Contribution to frailt? ............................................................................................................................ 77 APÊNDICE 3 Artigo “The consequences of growth hormone-releasing hormone receptor haploinsufficiency for bone quality and insulin resistance ................................ 91 APÊNDICE 4 Artigo “Lifetime congenital isolated GH deficiency does not protect from the development of diabetes” .................................................................................. 97 1 5 1 INTRODUÇÃO Por sua facilidade de medição a altura é um dos fenótipos mais estudados na infância pelo retardo ou avanço estatural; na idade adulta pela estatura final de indivíduos ou grupos populacionais; na senescência e pela redução estatural do envelhecimento. A definição da altura em todas as idades guarda um sincronismo com a atividade do eixo do hormônio do crescimento (GH)/Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I), com ativação na infância, pico no final da adolescência, e subsequente redução progressiva da atividade durante a vida adulta (JULL, et al., 1994). No envelhecimento, a altura diminui devido ao achatamento dos discos e dos corpos vertebrais e a acentuação da curvatura sagital da coluna vertebral associados à redução da densidade mineral óssea (DMO), e da quantidade da massa muscular (MM) do idoso (LÉGER, 1994). Em homens e mulheres entre 60 e 80 anos, a taxa média de diminuição da estatura é de cerca de dois centímetros por década, podendo atingir até 12 cm nos casos mais extremos de perda óssea total (GUCCIONE, 2002). Muitas regiões genômicas têm sido associadas à variação na altura, mas poucos dados foram confirmados em estudos populacionais (GUDBJARTSSON et al., 2008; LETTRE et al., 2008; LIU et al., 2008; WEEDON et al., 2008). Variações haplotípicas no gene do receptor do hormônio liberador do GH (GHRHR) constituem um fator importante para a variação da altura em populações normais. Recentemente foi demonstrado redução na altura de até 3,8 cm, em dois grupos populacionais independentes na Escandinávia (JOHANSSON et al., 2009). Mutações homozigóticas no GHRHR são importantes causas genéticas de baixa estatura (MARTARI & SALVATORI, 2009), sendo a mutação homozigótica c.57+1G>A no GHRHR que acomete cerca de 100 indivíduos na região de Itabaianinha, no nordeste do Brasil, a mais prevalente (SALVATORI, et al., 1999). Além da baixa estatura acentuada, quando adultos, os indivíduos homozigóticos afetados (MUT/MUT) apesentam aumento do percentual de gordura de predomínio central, com redução acentuada da MM (OLIVEIRA et al., 2010), porém com DMO volumétrica (DMOv) corrigida para o tamanho corporal, normal, em indivíduos abaixo (EPITÁCIO-PEREIRA. et al., 2013) e acima de 60 anos de idade (SOUZA, et al., 2013). Também o número de fraturas vertebrais por indivíduo acima de 60 anos foi menor nos indivíduos MUT/MUT que nos indivíduos normais, indicando um fenótipo ósseo benéfico nos indivídiuos MUT/MUT (SOUZA, et al., 2013), adaptado ao reduzido tamanho dos ossos e ao esforço muscular que desempenham, de acordo com a teoria do mecanostato (SCHOENAU, 2007). 1 6 Devido a existência de um grande número de indivíduos heterozigóticos (MUT/N) é relevante verificar se a falta de um alelo funcionante do GHRHR causa redução na altura,. Um trabalho anterior abordou esta questão em familiares paquistaneses dos “Anões do Sindh”, MUT/MUT para a mutação c.214 G>T no exon 3 do GHRHR. Neste trabalho foram examinados 22 indivíduos MUT/N e cinco homozigóticos normais (N/N) e não foi encontrado diferença na altura entre os dois grupos, sendo o escore de desvio padrão (EDP) da altura dos adultos maior que o das crianças e adolescentes (MAHESHAWARI, et al., 1998), sugerindo que a haploinsuficiência para o GHRHR pode causar atraso no crescimento ao invés de baixa estatura na idade adulta. A possível explicação para esse achado pode advir do efeito compensatório provocado pela ativação tardia do eixo GH/IGF-I, aliado a um possível aumento do tempo de crescimento, haja vista que indivíduos adultos MUT/N para a mutação c.57+1G>A no GHRHR não apresentam redução significativa na altura, nem do nível sérico de IGF-I (HAYASHIDA, et al., 2000; PEREIRA, et al., 2007). Neste último trabalho estudamos 76 indivíduos MUT/N entre 25 e 75 anos de idade para esta mutação e comparamos com 77 indivíduos N/N da mesma população. O modelo homeostático do índice de resistência à insulina (HOMAIR) do grupo MUT/N foi menor em relação ao N/N. O peso, o índice de massa corpórea (IMC), e massa muscular (MM), pregas cutâneas e circunferência do quadril e abdômen estavam reduzidos no grupo de indivíduos MUT/N. Enquanto a quantidade da massa gorda (MG) apresentou uma tendência de redução no grupo MUT/N em relação ao N/N, a percentagem de MG (% MG) e a relação cintura/quadril foram semelhantes entre os dois grupos (PEREIRA, R.M.C. et al, 2007). Por outro lado não houve diferença nos valores da resistência óssea, medida por ultrassonografia do calcâneo, entre os indivíduos MUT/MUT e N/N embora somente 10 % destes indivíduos tivessem mais de 60 anos de idade (GÓIS-JÚNIOR, et al., 2012). É possível que o efeito benéfico ósseo nos indivíduos MUT/MUT, se perca nos indivíduos MUT/N, que apresentam estatura adulta normal, e MM diminuída, com ossos mais frágeis em relação aos tamanhos corporais, e mais susceptíveis aos efeitos danosos do envelhecimento. Nossa hipótese é que a redução do eixo GH/IGF-I no grupo MUT/N presente na fase adulta pode se agravar na senescência contribuindo para redução de MM e ou alterações posturais, conduzindo a maior redução da altura nestes indivíduos. Neste trabalho serão estudados a estatura, o peso, índice de massa corpórea e pressão arterial e condições, como alcoolismo, tabagismo e diabetes, que podem influenciar a redução estatural nos indivíduos 1 7 MUT/N com mais de 60 anos, comparando-os com indivíduos adultos jovens. A frequência de heterozigose nos grupos jovens e idosos será comparada. A presente tese é um desdobramento da dissertação de mestrado “Composição corporal, perfil metabólico e inflamatório na heterozigose para uma mutação no gene do receptor do GHRH” e apresenta quatro artigos elaborados durante o doutorado em Ciências da Saúde. O primeiro artigo, “Longevity in untreated congenital growth hormone deficiency due to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene” (AGUIAR-OLIVEIRA et al., 2010) mostra que a longevidade dos indivíduos homozigotos afetados (MUT/MUT) e MUT/N é igual aos indivíduos normais (N/N) (Apêndice 1). O segundo “Old heterozygous individuals heterozygous for a null GH releasing hormone receptor mutation loose more height that normal subjects. Contribution to frailty?” (PEREIRA et al., 2014) foi submetido para publicação na Revista Endocrine é o núcleo da presente tese (Apêndice 2). Dois outros artigos completam o fenótipo dos MUT/N, “The consequences of growth hormone-releasing hormone receptor haploinsufficiency for bone quality and insulin resistance” (GOIS JUNOR, et al., 2012) mostra que mutações hetrozigóticas no GHRHR não tem impacto sobre parâmetros ultrassonométricos ósseos em indivíduos adultos jovens, porém estes indivíduos exibem um fenótipo magro e uma vantagem na sensibilidade à insulina, avaliada pelo HOMAIR (Apêndice 3). O quarto artigo, “Lifetime congenital isolated GH deficiency does not protect from the development of diabetes” (VICENTE, et al., 2013) mostra função da célula beta e sensibilidade insulínica normais nos indivíduos MUT/N (Apêndice 4). 18 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 HORMÔNIO DE CRESCIMENTO (GH) O GH é secretado pelos somatotrofos e têm na sua estrutura molecular 191 aminoácidos com peso molecular de 22.000 daltons. Em uma hipófise normal encontramos aproximadamente 3 a 5 mg de GH. A secreção diária de GH fica em torno de 400 a 700 μg, ocorre em pulsos, principalmente durante o sono. A sua meia- vida é de aproximadamente 20 minutos. (GREENSPAN; GARDNER; SOBACK, 2007 O GH é produzido no lobo anterior da hipófise, ou seja, na adenohipófise e tem como principal órgão alvo o fígado. A secreção hipofisária de GH é determinada por um triplo controle hipotalâmico exercido pelo GHRH, secretado em pulsos com ritmo circadiano, cuja amplitude e frequência aumentam, em crianças e adultos, uma hora após o sono profundo (SALVATORI et al., 1999), pela somatostatina e pela grelina (ROSICKA et al., 2002). A somatostatina participa da regulação da secreção de GH controlando a frequência dos pulsos de GH sem afetar a biossíntese do GH, enquanto o GHRH atua através de seu receptor específico (GHRHR), estimulando a secreção de GH (GIUSTINA; VELDHUIS, 1998). A grelina, um peptídeo encontrado nas células do estômago e no hipotálamo, dentre outros tecidos (ROSICKA et al., 2002), também estimula diretamente a secreção de GH. Uma vez secretado, o GH age através do seu receptor (GHR) estimulando a produção do IGF-I (AGUIAR- OLIVEIRA et al., 1999) (CORONHO; PETROIANER; MATOS SANTANA, 2001). (Figura 1). O GH exerce sua ação principalmente através do estímulo da produção de IGF-I. O IGF-I é produzido em diversos tecidos do organismo, principalmente no fígado, condrócitos, músculos, hipófise e trato gastrointestinal. Ele tem papel fundamental no desenvolvimento pré e pós-natal e exerce todos os seus efeitos fisiológicos por ligação com os receptores IGF-IR (LE ROITH, 1997). A ligação do GH com seu receptor hepático estimula a expressão e liberação do peptídeo IGF-I na circulação (DELAFONTAINE, 1995; JONES et al., 1995, LE ROITH, 1997). Seus efeitos são modulados por diversas proteínas carreadoras, as IGFBPs (JONES et al., 19 1995). O IGF-I circulante é gerado pelo fígado sob o controle do GH. A grande semelhança entre o IGF-I e a pró-insulina humana sugere a existência de um gene ancestral comum, o que pode explicar o fato da insulina ter ação semelhante ao IGF-I, desempenhando importante papel no crescimento fetal. HIPOTÁLAMO Receptor do GHRH (-) (+) Receptor do GH Grelina GHRH Somatostatina Receptor do IGF-I (+) (-) (-) HIPÓFISE GH EFEITOS INDIRETOS EFEITOS DIRETOS MÚSCULO/OSSO/CORAÇÃO FÍGADO TECIDO ADIPOSO (+) IGF-I Figura 1 – Esquema da regulação intrínseca do eixo GH-IGF-I. 2.2 DEFICIÊNCIA DE GH A deficiência do hormônio do crescimento (DGH) pode ser classificada como esporádica (congênita, adquirida, variante e idiopática) ou familiar (SALVATORI et al., 1999; 2001). A DGH familiar pode ser isolada (DIGH) ou associada à deficiência de múltiplos hormônios hipofisários. A DIGH é pouco frequente, ocorrendo em cerca de 1:4.000 a 1:10.000 nascidos vivos, e tem uma ocorrência familial em 5 a 30 % dos casos. Vários modelos de herança têm sido descritos, sendo o mais frequente o autossômico recessivo (MULLIS, 2005). 20 No caso da DIGH genética, três diferentes tipos de herança são descritas (PHILIPS et al., 1981):  Tipo I – Autossômica recessiva: o Tipo Ia - com níveis séricos ausentes de GH o Tipo Ib - com níveis séricos bastante reduzidos de GH  Tipo II - Autossômica dominante  Tipo III - Ligada ao cromossomo X O tipo Ia ocorre por deleção do gene GH-1, sendo comum o aparecimento de anticorpos anti-GH o que frustra a possibilidade de tratamento com GH. É a forma mais severa de DIGH, com retardo do crescimento já aparente nos primeiros seis meses de vida, algumas vezes associado com episódios de hipoglicemia. Já o tipo Ib é a forma mais frequente, sendo causada por mutações no gene GH-1 ou mais frequentemente por mutações homozigóticas ou heterozigóticas compostas do GHRHR, na qual os pacientes têm níveis baixos de GH, mas detectáveis. Estes pacientes não produzem anticorpos anti-GH em quantidades suficientes para impedir a resposta terapêutica ao GH exógeno. (COGAN et al., 1994). A primeira mutação no GHRHR, c.214 G>T no exon 3, levando a DIGH tipo Ib, foi descrita em três famílias do subcontinente indiano, das quais a mais conhecida é a dos “Anões de Sindh” (MAHESHAWARI et al., 1998 , NETCHINE et al., 1998). O “nanismo de Sindh” representa o homólogo humano do “little mouse” descrito em 1976, em que a mutação no GHRHR abole o sítio de ligação para o GHRH, o que leva a uma resistência à sua ação, hipoplasia pituitária e deficiência isolada de GH (BAUMANN et al., 1997). O segundo tipo de mutação no GHRHR foi descrito em 105 indivíduos da região de Carretéis e arredores, em Itabaianinha-SE. Trata-se de uma mutação homozigótica tipo “splice” no início do íntron I no sítio doador de emendas, onde a G (Guanina) foi substituída pela A (Adenina) (c.57+1G>A), figura 2. Essa mutação impede a síntese de RNA mensageiro (RNAm) do receptor de GHRH, resultando em um receptor de GHRH completamente truncado, o que conduz a uma deficiência severa de GH (SALVATORI et al., 1999). 21 Figura 2. Mutação homozigótica no sítio de “splicing” do íntron 1 no gene do receptor do hormônio liberador do hormônio do crescimento, ocorrendo troca de bases, Guanina (G) por Adenina (A) c.57+1G>A, WT (indivíduo normal – N/N), MUT (indivíduo mutado – MUT/MUT). Os indivíduos DIGH tipo II apresentam níveis séricos de GH baixos, mas detectáveis, geralmente com boa resposta ao tratamento com GH. A DIGH tipo III apresenta manifestações clínicas distintas nas diferentes famílias. Alguns pacientes podem apresentar agamaglobulinemia associada à deficiência de GH, sugerindo que o tipo III de DIGH pode se dever a defeitos em genes contíguos ou a mutações em múltiplos locus (BOGUSZEWSKI et al., 2001). 2.3 ASPECTOS FENOTÍPICOS DA MUTAÇÃO EM HOMOZIGOSE NO GHRHR Em Itabaianinha os indivíduos homozigóticos (MUT/MUT) para esta mutação apresentam um aspecto fenotípico marcante, associado à redução acentuada dos níveis de IGF-I, IGF-II, ALS e IGFBP-3 (AGUIAR-OLIVEIRA et al., 1999). As características mais marcantes da DIGH foram: baixa estatura importante (escore de desvio padrão da altura entre -4 e -8, altura final em homens foi entre 117 e 137 centímetros e em mulheres entre 107 e 126 centímetros), fronte proeminente, voz com timbre alto e agudo (SOUZA et al., 2004), redução da massa muscular com aumento do percentual de gordura abdominal, e aumento do LDL colesterol em crianças e adultos (BARRETO et al., 1999; GLESSON et al., 2007>). Além disto, foi observado aumento da pressão sistólica quando comparadas à adultos normais para mesma idade e sexo (BARRETO-FILHO et al., 2002) porém sem evidências de aterosclerose 22 prematura (OLIVEIRA et al., 2006) ou resistência insulínica (BARRETO-FILHO et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2010) encontradas em outros modelos de DGH de inicio na vida adulta (AMATO et al., 1993; GOLA et al., 2005). Um estudo recente com indivíduos MUT/MUT mostrou longevidade normal (AGUIAR-OLIVEIRA et al., 2010). A DMO volumétrica, corrigida para o tamanho corporal foi normal nos indivíduos MUT/MUT, abaixo (EPITÁCIO-PEREIRA et al., 2013) e acima de 60 anos de idade (SOUZA et al., 2013). Também o número de fraturas vertebrais por indivíduos foi menor nos indivíduos MUT/MUT que nos indivíduos normais, indicando um fenótipo ósseo benéfico nos indivídiuos MUT/MUT (SOUZA et al., 2013), adaptado ao tamanho dos ossos e ao esforço muscular, em acordo com a teoria do mecanostato ( SCHOENAU, 2007). 2.4 GH, PERFIL ÓSSEO, ENVELHECIMENTO E LONGEVIDADE. A partir do começo da década de 80, houve um crescente número de estudos envolvendo o fenótipo ósseo e o eixo GHRH-GH-IGF-I. Pesquisas in vitro (OHLSSON et al., 1998), em ratos (KALU et al., 1984; WRIGHT et al., 1995) e em macacos (SASS et al., 1997) foram realizadas com o objetivo de verificar os possíveis efeitos do GH, IGF-I e GHRH na manutenção ou possível ganho de massa óssea em indivíduos com DGH de início na idade adulta. Alguns estudos, demonstraram que o eixo GH/IGF-I representa um importante papel no metabolismo e na resistência óssea, e que a deficiência do GH predispõe a perda da massa óssea (YAKAR et al., 2002; PETEL et al., 2005) e aumento do risco de fratura (ROSEN et al., 1997; HOLMER et al., 2007). A queda do IGF-I observada no processo de envelhecimento seria um mecanismo envolvido com a perda de massa óssea após a sexta década de vida, passível de correção pela administração do GH exógeno (KATZMANN et al., 1998; ROSEN & DONAHUE, 1998). Em humanos, a DGH nos adultos causa mudanças que são similares ao envelhecimento normal, incluindo aumento na massa de gorda, redução na massa e força muscular, piora da qualidade de vida, redução da densidade mineral óssea, aumento do colesterol total e LDL e o espessamento das paredes arteriais (MOLITCH et al., 2006). A maioria destas mudanças é revertida com a terapia de substituição do 23 GH. Embora o aumento da mortalidade tenha sido observado em pacientes com hipopituitarismo com terapia de substituição dos hormônios hipofisários sem o GH (ROSEN et al., 1990), nenhum estudo mostrou claramente que aquela mortalidade é causada pela falta de GH, ou que esta situação se inverteu com a terapia de substituição com GH exógeno. Desde que o envelhecimento normal foi associado com a redução progressiva de secreção de GH (somatopausa), e algumas das mudanças do envelhecimento podem ser revertidas com a terapia de GH (BLACKMAN et al., 2002), foi proposto que a somatopausa seja pelo menos em parte responsável pelo processo de envelhecimento. Por esta razão, a terapia de reposição com GH é defendida frequentemente como um tratamento antienvelhecimento. Porém, a relação entre o declínio na secreção de GH e envelhecimento em humanos ainda é controverso. De forma interessante, a razão para o declínio da secreção do GH relacionado com a idade não está em alterações de função das células somatotróficas, mas na alteração do controle hipotalâmico da secreção de GH, possivelmente com uma combinação de redução da secreção GHRH e aumento da secreção da somatostatina. Como previamente demonstrado, nos idosos as células somatotróficas permanecem normalmente responsivas ao GHRH (GHIGO et al., 1990). A pergunta se o status de DGH tem um efeito positivo ou negativo no tempo de vida dos seres humanos ainda não foi respondida. Besson e outros mostraram recentemente que os 11 componentes de duas famílias da Suíça do século 19 com DIGH (devido à deleção do gene GH1) viveram menos que seus irmãos. Entretanto, este estudo retrospectivo é limitado pelo tamanho da amostra (BESSON et al., 2003). No único estudo prospectivo publicado até o momento, foi relatada uma população portadora de hipopituitarismo com a taxa de mortalidade aumentada e risco cardiovascular de 1:8 comparados com a população geral (TOMLINSON et al., 2001). Embora somente uma minoria destes pacientes tenha sido testada para DGH, é provável que a maioria deles seja portadora de DGH, porque o GH é geralmente o primeiro hormônio cuja produção é reduzida na presença de doença pituitária (HARTMAN et al., 2002). Entretanto estes indivíduos eram altamente heterogêneos, e uma grande porcentagem deles foi submetida a cirurgia ou radioterapia da região hipotalâmica hipofisária, que por si só influencia a sobrevida (principalmente a 24 radioterapia) (BRADA et al., 2002). Outros autores não confirmaram um aumento da mortalidade associado com o hipopituitarismo (BATES et al., 1999). A maioria dos estudos humanos foi realizada em pacientes portadores de panhipopituitarismo, com terapias múltiplas de substituição hormonal (glicorticóides, L-tiroxina e esteroides sexuais) e sofreram cirurgia ou irradiação pituitária ou hipotalâmica. Por isso, é possível que os efeitos sobre a mortalidade, sejam pelo menos em parte, secundária a terapias anteriores ou imprecisão na substituição terapêutica. Em adição, propôs-se que a mortalidade cerebrovascular nos pacientes com tumores pituitários pode estar ligada a radioterapia, que pode causar danos vasculares diretos (BRADA et al., 2002). Consequentemente, permanece obscuro se o aumento da morbimortalidade cardiovascular esta associado com o tratamento de panhipopituitarismo e de DGH não tratada, ou de fatores adicionais de confusão. Desde que a DGH isolada (DIGH) é rara, é difícil estudar pacientes que tenham deficiência exclusiva de GH. Nossos dados demonstram que na DIGH congênita e grave, devido a uma mutação no GHRHR, não apresenta evidência de aterosclerose prematura (MENEZES OLIVEIRA et al., 2006) ou redução da longevidade (AGUIAR-OLIVEIRA et al., 2010). A longevidade nessa família é normal apesar da presença de fatores de risco óbvios para doença cardiovascular com pressão sanguínea aumentada, colesterol total e LDL aumentado, proteína C reativa aumentada e adiposidade abdominal (BARRETO-FILHO et al., 2002). 2.5 FENÓTIPO DOS INDIVÍDUOS HETEROZIGOTOS O conceito de que uma doença recessiva requer um mau funcionamento de ambos os alelos, paterno e materno, tem sido desafiado por alguns exemplos mostrando que indivíduos MUT/N para a mutação recessiva exibem um fenótipo intermediário entre os indivíduos MUT/MUT e N/N. Mutações inativadoras em homozigose do gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL) causam hipercolesterolemia severa e doença arterial coronariana prematura, enquanto MUT/N levam a hipercolesterolemia moderada e doença arterial coronariana em uma idade mais tardia (JANSEN et al., 2002). Mutações em homozigose do gene do receptor sensor do cálcio causam hiperparatiroidismo neonatal severo enquanto as mutações 25 em heterozigose causam hipercalcemia e hipocalciúrica familiar benigna (HENDY et al., 2000). Mutação em homozigose do gene do receptor B do peptídeo atrial natriurético causa displasia óssea severa (displasia acromesomélica) enquanto indivíduos MUT/N apresentam apenas uma baixa estatura discreta (OLNEY et al., 2006). Finalmente, a obesidade é mais acentuada em indivíduos MUT/MUT que em indivíduos MUT/N portadores de mutações do gene do receptor da melanocortina tipo quatro (FAROOQI et al., 2003). Previamente estudamos 76 indivíduos portadores da mutação c.57+1G>A ,em apenas um dos alelos, no GHRHR (MUT/N). Apesar de estatura normal e níveis sanguíneos normais de IGF-I, eles mostraram redução significativa na massa muscular. Semelhantemente aos indivíduos com DGH, eles apresentaram índice de modelo homeostático de avaliação da resistência à insulina (HOMAIR) menor que os indivíduos N/N, sugerindo que indivíduos MUT/N para a mutação GHRHR tenha sensibilidade à insulina aumentada (PEREIRA et al., 2007). Outro aspecto de heterozigose é a redução do volume da tireóide em valor absoluto e mesmo corrigido para superfície corporal (ALCANTARA et al., 2006). 2.6 ENVELHECIMENTO E MUDANÇAS POSTURAIS NO IDOSO O envelhecimento pode ser definido como um processo irreversível, caracterizado por alterações funcionais e estruturais de diversos órgãos e sistemas que variam de um indivíduo para outro. A senescência é o processo natural de envelhecimento ao nível celular ou o conjunto de fenômenos associados a este processo. Este conceito se opõe à senilidade, também denominado envelhecimento patológico, e que é entendido como os danos à saúde associados com o tempo, porém causados por doenças ou maus hábitos de saúde. O crescimento da população de idosos é um fenômeno mundial e está sendo enfatizado, principalmente nas implicações sociais e em termos de saúde pública. A Organização Mundial de Saúde (OMS) previu que, em 2025, a população mundial de pessoas com mais de 60 anos será de, aproximadamente, 1,2 bilhões, sendo que os muitos idosos (com 80 anos ou mais) constituem o grupo etário de maior crescimento (WHO, 2004). Segundo estimativa do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em uma série de projeções populacionais, baseada no Censo de 2010, a população com faixa etária 26 acima de 65 anos deve passar dos atuais 7,4% do total, para mais de 14% em 2025 (CENSO DEMOGRÁFICO, 2000. RIO DE JNANEIRO. INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE), 2000). Nesta época o Brasil terá uma proporção de idosos semelhante à que é hoje registrada em países desenvolvidos (COELHO FILHO & RAMOS, 1999). Dentre as alterações do envelhecimento, destaca-se a redução da massa óssea devido a desproporção entre as funções dos osteoblastos e osteoclastos, a partir da quarta década de vida, presente em ambos os sexos, porém com maior intensidade no sexo feminino, principalmente nas pós-menopáusicas em virtude da redução nos níveis estrogênicos (GALI, 2001; GUCCIONE, 2002). Neste período, a reabsorção óssea começa a preponderar sobre o processo de formação do osso, levando à diminuição da massa óssea. Esse desequilíbrio na remodelagem óssea de forma mais intensa predispõe a osteoporose. A redução na densidade dos ossos dá-se mais precocemente na coluna vertebral que nos membros. A perda óssea em mulheres é mais prematura, a partir dos 35 anos de idade e apresenta um índice de perda de aproximadamente 1% ao ano enquanto que em homens acontece em uma taxa média de perda de 0,4% por ano, iniciando-se entre os 50 ou 55 anos de idade. Em homens e mulheres entre 60 e 80 anos, a taxa média de diminuição na altura é de cerca de dois centímetros por década, podendo atingir até 12 cm nos casos mais extremos de perda óssea (GUCCIONE, 2002). De acordo com CAROLYN KISNER (2000), a coluna, considerada pilar anatômico, é constituída por corpos vertebrais e discos intervertebrais, é a porção hidráulica, sustentadora de peso e absorvedora de choques. Os pilares posteriores, constituídos pelos processos articulares e facetas articulares, são o mecanismo deslizante para o movimento. Também, parte da unidade posterior é constituída de arcos vertebrais, dois processos transversos e um processo espinhoso posterior central. Os músculos inserem-se nos processos a partir de onde conduzem o movimento. Segundo GUCCIONE (2002), com o processo do envelhecimento, a arquitetura óssea que compõe e sustenta o corpo humano sofre uma considerável alteração, no que diz respeito tanto a densidade mineral quanto a microarquitetura óssea, que altera as propriedades e a proporção relativa dos elementos do tecido 27 conjuntivo do disco intervertebral. A elastina torna-se menos distensível e pode sofrer fragmentações sucessivas. A diminuição de massa óssea está associada à diminuição ou aumento nas concentrações de hormônios (estrogênio, hormonio tireoideano, dentre eles a calcitonina, hormônio da paratireoide, corticosteroides e progesterona), a fatores nutricionais (deficiência de vitamina D, e de cálcio), a imobilidade (fraturas, sedentarismo), as doenças osteoarticulares (artrite reumatóide) e a fatores genéticos relacionados a biótipo, raça e peso. (MAZO, LOPES E BENEDETTI, 2001; MATSUDO, 2001) . Segundo MAGEE (2002) “postura é um composto das posições das diferentes articulações do corpo num dado momento. A postura correta é a posição na qual um mínimo de estresse é aplicado em cada articulação”. Já para PALMER & APLER (2002) “a postura correta consiste no alinhamento do corpo com eficiências fisiológicas e biomecânicas máximas, o que minimiza os estresses e as sobrecargas sofridas ao sistema de apoio pelos efeitos da gravidade”, portando a postura é muito particular para cada indivíduo e estão envolvidos diversos fatores como fraqueza muscular, baixa autoimagem, tensão emocional ou psicossocial e também a imitação dos hábitos dos pais . Tudo isso pode levar a má postura fazendo com que a pessoa curve-se para diante (BARRIE PICKLES, 2000). As alterações posturais se iniciam após os quarenta anos de idade que contribui para a posição inclinada e a redução da estatura que caracteriza as pessoas idosas (BARRIE PICKLES, 2000). Durante o processo natural de envelhecimento, ocorre diminuição das reservas funcionais do organismo em todos os aparelhos e sistemas. A velocidade e extensão desse declínio variam muito entre os diversos tecidos e funções, como variam também entre indivíduo. As perdas observadas ao nível dos sistemas refletem a perda de células em decorrência da idade, ou diminuição da capacidade de um grupo de células no exercício de sua função especializada. Considera-se que o envelhecimento traz modificações físicas que aparecem em um dado momento de forma quantificável. A pessoa vê sua estatura diminuir. O tamanho do esqueleto diminui devido a um duplo fenômeno: o achatamento dos discos e dos corpos vertebrais e a acentuação da curvatura sagital da coluna vertebral. A largura dos ombros e os diâmetros biacromiais se reduzem. O diâmetro ântero-posterior do tronco aumenta (LÉGER, 1994). A cifose torácica é a mais frequente entre as anomalias posturais que se 28 instalam com o avançar da idade. Este aumento da curvatura torácica acompanha-se de alterações da lordose lombar, ampliação do ângulo de flexão do joelho; o deslocamento da articulação coxofemoral para trás; e a inclinação do tronco para diante, acima dos quadris. (BARRIE PICKLES, 2000). A alteração da postura corporal é um dos problemas mais frequentes relacionados ao envelhecimento, pois há uma dificuldade na execução dos movimentos com rapidez. Desta forma, o equilíbrio corporal fica mais difícil, sendo de extrema importância que se conheçam as transformações que ocorrem na postura corporal com o processo de envelhecimento, de modo que possam ser adotadas medidas preventivas e até corretivas desta postura, a fim de evitar dores, deformidades, dificuldades de locomoção e equilíbrio, melhorando a qualidade de vida desses indivíduos. 2.7 JUSTIFICATIVA O estudo do efeito entre idade e fenótipo na heterozigose para a mutação de Itabaianinha, pode ser ampliado para a compreensão da longevidade e do fenótipo na senescência ou senilidade em indivíduos aparentemente normais, porém heterozigóticos para a mutação c.57+1G>A no GHRHR. 29 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL  Estudar o efeito da idade no fenótipo em heterozigose (MUT/N) para a mutação c.57+1G>A no gene do receptor do hormônio liberador do GH. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Avaliar o efeito da idade na altura dos indivíduos MUT/N  Analisar o efeito da idade no peso dos indivíduos MUT/N  Verificar o efeito da idade no IMC nos indivíduos MUT/N  Verificar o efeito da idade na pressão arterial nos indivíduos MUT/N  Avaliar a longevidade dos indivíduos MUT/N para a mutação c.57+1G>A 30 4 CASUÍSTICA E MÉTODOS 4.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO A população estudada situa-se no município de Itabaianinha, região oeste do centro-sul do estado de Sergipe. Possui, cerca de, 39 mil habitantes (IBGE, 2010) e 2 extensão territorial de 478 Km , onde a agricultura prevalece como atividade econômica para sustento das famílias (Figura 3). Nessa região, a DIGH é doença autossômica recessiva com grau de consanguinidade alto (SALVATORI, et al., 1999; SOUZA et al., 2004), cuja frequência fenotípica é bastante elevada, cerca de 1:279, torna-se maior ainda se considerarmos Carretéis, berço dos anões, que é um aglomerado rural a 14 km ao norte da sede do município (composto de treze povoados), aonde chega a 1:32 (SOUZA, 1997). Figura 3- Mapa da Região de Itabaianinha, Sergipe, Brasil. 4.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO DO ESTUDO Os critérios de inclusão foram: - O indivíduo ser natural de Itabaianinha e arredores; - Não ser parente de DIGH em primeiro, segundo e terceiro grau (primeiro grau seriam os pais, filhos e irmãos; segundo grau os avós, netos, tios e 31 sobrinhos e o terceiro grau primos, bisavós e bisnetos), com objetivo de excluir que outros genes para estatura ou longevidade posam estar hiper-representados na amostra. - Estar entre 20 e 40 anos (grupo jovem) e 60 a 80 anos (grupo idoso). 4.3 TIPO DE ESTUDO Um estudo transversal foi realizado em 843 indivíduos para comparar a frequência de MUT/N e N/N para a mutação c.57 + 1 G>A no GHRHR em dois grupos aparentemente normais: um grupo jovem com idade entre 20-40 anos (500 jovens, sendo 245 homens e 255 mulheres), e outro idoso, com idade entre 60 a 80 anos (343 idosos, sendo 179 homens e 164 mulheres) residentes na cidade de Itabaianinha. 4.4 MÉTODOS Foram realizadas reuniões na “Associação do Crescimento Físico e Humano de Itabaianinha - ASCRIM” e solicitados aos anões que divulgassem na comunidade a necessidade de voluntários para este novo trabalho que iríamos realizar. As coletas foram realizadas em duas etapas com viagens à Itabaianinha. Para sensibilizar a população a aderirem como voluntários, contamos com anúncios em rádios da cidade (AM e FM), faixas foram colocadas em pontos estratégicos da cidade (em praças públicas: na Praça da Igreja Matriz e na feira) para que chamasse atenção da população, a comparecerem nos dias das coletas divulgados previamente (Figura 4). Em cada viagem contamos com uma equipe de alunos do curso de Medicina que auxiliaram na coleta de dados, todos foram previamente treinados e estavam uniformizados com camisetas identificadas com o nome da Universidade Federal de Sergipe (Figura 4 e 5). A amostra foi selecionada aleatoriamente durante a votação do processo eleitoral de Outubro de 2008. Fizemos uma solicitação à Juíza Dra. Aline Cândido Costa da 10ª Zona Eleitoral de Itabaianinha/SE, para fazermos uma coleta para nosso estudo durante as Eleições de 2008 e a resposta foi positiva (ANEXO 1). 32 Foi montada um ponto de apoio na praça central de Itabaianinha próximo ao supermercado G. Barbosa que foi identificada com faixa da Universidade Federal de Sergipe. Nesta barraca, uma equipe de aproximadamente 21 pessoas, formando 7 grupos de três pessoas, identificadas com camisas da UFS, acolhia os indivíduos interessados em participarem da pesquisa. As tendas continham todo material necessário (mesas, cadeiras, formulários das entrevistas, balanças digitais portáteis, estadiômetros portáteis afixados em paredes de madeira, material para coleta de DNA com swabs bucais e aparelhos para aferir a pressão), todos participantes assinaram os Termos de Consentimento Livre e Esclarecidos (TCLE) (ANEXO 2). A autora armazenou e recolheu todo o material colhido acondicionando as entrevistas e os Termos de Consentimento em caixas específicas e os swabs bucais em recipiente de isopor apropriado. Ao mesmo tempo uma equipe volante convidava as pessoas nas áreas próximas aos postos de coleta para participar do estudo. O indivíduo era convidado a participar do estudo, caso concordasse, era apresentado o TCLE e obtido sua assinatura. Em seguida começava o procedimento da coleta de dados que consistia na resposta do participante a entrevista onde ele respondia diversas perguntas, dentre elas: nome, endereço, data de nascimento, idade, peso e altura (eram aferidos pelo pessoal treinado), diagnóstico de diabetes (auto aferido com resposta de sim ou não), parentesco com DIGH, qual o tipo de parentesco, se era fumante e indicadores de alcoolismo (ANEXO 3). Não foi realizado a glicemia capilar, analizada em outro trabalho anterior (VICENTE et al., 2013). Cada grupo de três participantes mediu a altura, o peso, a pressão arterial e colheu o esfregaço bucal. Foram obtidos 793 indivíduos nesta etapa. 33 Figura 4: Equipe de alunos coletando dados. Figura 5: Apoio armado na Praça da Igreja Matriz para coleta de dados. Após a eleição, fizemos uma nova coleta, para aumentarmos o número de indivíduos idosos, envolvemos as Igrejas Católica a 1ª Igreja Batista, após consentimento dos respectivos responsáveis. Nesta etapa solicitamos apoio para coleta dentro das igrejas (Figura 6). Fizemos coletas logo após os horários das missas e cultos no sábado e domingo. Nesta etapa foram obtidos 50 indivíduos. 34 Figura 6: Professor Dr Manuel Hermínio solicitando a adesão da população durante a missa católica na Igreja Matriz da Imaculada Conceição de Itabaianinha. A medição da altura (cm) foi realizada em estadiômetro compacto vertical portátil afixado em uma parede de madeira da marca Wiso-Brasil. Esta medida foi realizada com o indivíduo descalço sobre a plataforma, calcanhares juntos, nádegas e ombros em contato com o eixo vertical do instrumento e foi exercida leve pressão no processo mastóide para cima com a média de três medidas consecutivas realizada pela mesma pessoa (BARRETTO et al., 1999; BARRETO-FILHO et al., 2002). O estadiômetro Wiso é um dispositivo para medição de altura fixo na parede, seu campo de medição é de 0 a 210 cm. É um instrumento preciso, com resolução em milímetros, de alta resistência, fácil de usar e de ser instalado o que foi de extrema importância para nosso estudo. Ele é composto basicamente de três partes: o suporte de fixação, a fita e a base com o visor. Para montá-lo escolhemos uma parede de 35 madeira para fixação do aparelho, em seguida esticamos a fita até que a mesma atingisse a marca "0" (zero). A base com o visor estava junto à parede, na parte de baixo da mesma, encostando suas faces, no chão e na parede. Com o auxílio de uma escada, encostamos o suporte de fixação, na parte superior da parede e deixamos a fita totalmente esticada, de cima para baixo, e verificamos se o visor apontava exatamente para a marca "0" (zero). A pesagem (Kg) em balança digital (marca Tech Line-Brasil) com o indivíduo descalço e uma média de três pesagens. A balança digital Tech Line-Brasil tem a capacidade de pesar até 180 Kg, conta com visualização de modo digital de 100 em 100 g e funciona com uma bateria de lítio, é leve e de fácil transporte. O índice de massa corpórea (IMC) foi calculado através da fórmula 2 2 Peso/(Altura) kg/m . O IMC foi expresso em valore absoluto. A coleta do DNA foi realizada através de swab bucal da seguinte maneira: o indivíduo era instruído para bochechar três vezes com água e em seguida, a pessoa, treinada para coleta, introduzia na cavidade oral do indivíduo, um swab com borda em escova e fazia uma fricção suave na face interna de cada bochecha por aproximadamente 30 segundos. O esfregaço era colhido em duplicata sendo uma amostra enviada para genotipagem na Universidade Jonhs Hopkins e outra guardada em refrigerador. Assim que a genotipagem era concluída descartava-se a segunda amostra. Ao ser acondicionado no invólucro o swab, que já deveria estar identificado com o nome do indivíduo e data da coleta e só então era lacrado e acondicionado em refrigeração. A genotipagem através do produto de PCR para a mutação c.57 + 1 G>A no GHRHR (rs2302022) foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular de Dr Roberto Salvatori na Universidade Johns Hopkins, em Baltimore/EUA, utilizando o sistema TaqMan® SNP Genotyping Assay C__15757069_10 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A PCR e a detecção da fluorescência final foram realizadas no sequenciador Prism ABI 7900HT, com protocolos fornecidos pelos fabricantes. Nos resultados observados, os indivíduos N/N apresentaram uma única banda, os indivíduos MUT/MUT, também apresentaram uma única banda de migração, contudo mais lenta que os indivíduos N/N. Os indivíduos MUT/N, apresentaram quatro bandas: o alelo normal e o alelo afetado e duas bandas correspondentes a 36 heterodímeros gerados durante a amplificação por PCR (SALVATORI et al., 1999) (Figura 7). N/N MUT/MUT MUT/N Figura 7 – Esquema representativo das bandas após DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) em indivíduos de Itabaianinha-SE. Indivíduos Homozigóticos normais (N/N) apresentaram uma única banda, indivíduos Homozigóticos afetados (MUT/MUT), uma única banda mais lenta e os Heterozigóticos (MUT/N), quatro bandas, a do alelo normal e a do alelo mutante e duas bandas mais lentas que representam heterodímeros gerados pelo anelamento das fitas anterior e posterior dos alelos de G (Guanina) e A (Adenina) durante amplificação do PCR. SALVATORI et al, J Clin Metab, v.84, n.3, p.917-923, 1999. A aferição da pressão arterial (mmHg) foi realizada com a média de três medidas obtidas no braço não dominante do indivíduo, depois de 10 minutos de repouso na posição sentada por pessoal treinado previamente utilizando um esfigmomanômetro de mercúrio composto pelo manômetro e manguito que deve ter um tamanho adequado para o braço de um adulto e com a ajuda de um estetoscópio descrita pela VI Diretriz Brasileira de Hipertensão (2010). As variáveis estudadas foram: altura, peso, IMC, pressão arterial diastólica (PAD) e pressão arterial sistólica (PAS). O EDP do peso, EDP da altura e EDP do IMC de cada indivíduo de ambos os grupos, foi calculado usando o site http://www.phsim.man.ac.uk/SDSCalculator/SDSCalculator.aspx. Com referência aos indicadores de consumo de álcool por quantidade semanal de uso foi perguntado aos entrevistados qual das opções abaixo ele responderia (Tabela 1). 37 Tabela 1: Indicadores de Consumo de Álcool Quantidade Semanal Classificação Nada Não Consome Até 3 doses (destilada) ou Consumo leve garrafas (fermentadas) De 3 a 7 doses (destilada) ou Consumo moderado garrafas (fermentadas) Acima de 7 doses (destilada) ou Consumo elevado garrafas (fermentadas) O atual trabalho faz parte do projeto de pesquisa “Consequências da deficiência isolada e vitalícia do GH” e foi submetido aos Comitês de Ética e Pesquisa, da Universidade Johns Hopkins e da Universidade Federal de Sergipe tendo sido aprovado com o parecer número 043/204, e registro no CONEP sob o número 10212 (ANEXO 4). 4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA As variáveis foram comparadas pelo teste T de student. O teste de qui quadrado comparou a proporção de indivíduos MUT/N nos dois grupos. O teste de Fisher foi usado para comparar os possíveis fatores que influenciam o fenótipo de cada grupo, ou seja, o alcoolismo, tabagismo e diagnóstico auto-referido de diabetes. Estimamos um p de 0,05 ou menos para ser considerado estatisticamente significante. 38 5 RESULTADOS A tabela 2 mostra os valores absolutos e do EDP da altura, do peso, do IMC e os valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) por genótipo no grupo jovem. Tabela 2: Valores absolutos e Escore desvio padrão (EDP) da altura, peso, índice de massa corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos) 20 a 40 anos N/N MUT/N p N=461 N=39 Altura (cm) 163,1 (8,7) 160,8 (9,4) 0,16 EDP Altura -1,2 (1) -1,4 (1,2) 0,30 Peso (Kg) 65,3 (12,8) 62,5 (20,3) 0,49 EDP Peso -0,1 (1,4) -0,6 (1,8) 0,03 2 IMC (Kg/m ) 24,4 (4,4) 24,2 (6,5) 0,24 EDP IMC 0,3 (1,4) 0,1 (1,4) 0,06 PAS (mmHg) 122,5 (18) 122,2 (16,7) 0,75 PAD (mmHg) 79,6 (13,3) 78,5 (10,4) 0,49 39 A tabela 3 mostra as frequências referidas das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes mellitus por idade e por genótipo no grupo jovem. Tabela 3: Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes por genótipo no grupo jovem (20 – 40 anos) 20 a 40 anos N/N MUT/N p N=461 N=39 Tabagismo – n (%) Não Fumante 363 (84) 17 (85) 0,17 Fumante atual 66 (15) 2 (10) Fumante anterior 3 (1) 1 (5) Sem resposta 29 19 Consumo de Álcool – n (%) Não consome álcool 188 (44) 13 (65) 0,15 Consumo leve 136 (32) 2 (10) Consumo moderado 61 (14) 2 (10) Consumo alto 40 (9) 3 (15) Etilista anterior 5 (1) 0 (0) Sem resposta 31 19 Diabetes Mellitus– n (%) Não é diabético 441 (99) 34 (100) > 0,99 É diabético 5 (1) 0 (0) Sem resposta 15 5 40 As tabelas 4 e 5 mostram os mesmos dados das tabelas 2 e 3 para o grupo idoso. Observa-se redução do EDP do peso (p=0,03) , enquanto o IMC apresentou uma tendência de redução (p=0,06) no grupo MUT/N jovem. Não houve diferença entre alcoolismo, tabagismo e diagnóstico auto-referido de diabetes. Tabela 4: Valores absolutos e escore desvio padrão (EDP) da altura, peso, índice de massa corpórea (IMC). Valores absolutos da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) por genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos). 60 a 80 anos N/N MUT/N p N=319 N=24 Idade 68,3 (6,90) 68,0 (7,72) 0,84 Altura (cm) 155,9 (8,7) 151,8 (8,0) 0,02 EDP Altura -2,4 (1) -2,8 (1,1) 0,04 Peso (Kg) 62,8 (12,4) 59,8 (13,0) 0,25 EDP Peso -0,5 (1,6) -0,8 (1,9) 0,52 2 IMC (Kg/m ) 25,8 (4,5) 26,2 (6,1) 0,67 EDP IMC 0,7 (1,4) 0,7 (1,4) 0,96 PAS (mmHg) 143,9 (22,2) 147,1 (23,2) 0,65 PAD (mmHg) 84,8 (13,9) 86,5 (12,4) 0,46 41 Tabela 5: Frequências das categorias de tabagismo, uso e consumo de álcool e diabetes por genótipo no grupo idoso (60 – 80 anos) 60 a 80 anos N/N MUT/N p N=319 N=24 Tabagismo – n (%) Não Fumante 230 (74) 12 (75) 0,87 Fumante atual 68 (22) 4 (25) Fumante anterior 11 (4) 0 (0) Sem resposta 10 8 Consumo de Álcool – n (%) Não consome álcool 233 (75) 11 (73) 0,15 Consumo leve 55 (18) 1 (7) Consumo moderado 12 (4) 2 (13) Consumo alto 5 (2) 1 (7) Etilista anterior 5 (2) 0 (0) Sem resposta 9 9 Diabetes – n (%) Não é diabético 262 (85) 23 (96) 0,23 É diabético 48 (15) 1 (4) Sem resposta 9 0 42 A figura 8 mostra a representação gráfica da altura e EDP da altura, peso e EDP do peso, no grupo jovem e no grupo isoso. Figura 8: Representação gráfica da altura (cm), EDP da altura, peso (Kg) e EDP do peso nos indivíduos jovens (A) e idosos (B). 43 A diferença de altura encontrada entre o grupo N/N e MUT/N jovem; 2,35 cm menor nos indivíduos MUT/N que nos N/N; não apresentou estatística. O grupo MUT/N idoso apresentou redução estatural sendo 4,16 cm menor que o N/N (p=0,02). O EDP da altura também foi menor nos indivídos idosos MUT/N vs N/N, (- 2,79 ±1,1 e -2,37 ±1,0, p=0,04). Não houve diferença na prevalência do genótipo MUT/N nos dois grupos: jovem 39/500 (7,8%) e idoso 24/343 (7,0%) sugerindo efeito nulo da heterozigose da mutação c.57 +1 G> A no GHRHR na longevidade. Demonstrou-se um fenótipo diferenteda estatura na vida adulta a na senescência. 44 6 DISCUSSÃO Enquanto as maiorias das doenças autossômicas recessivas manifestam fenótipo apenas quando ambos os alelos são defeituosos, existem muitos exemplos de fenótipo parcial causadas por um defeito de um único alelo ("efeito de dosagem de gene"). Exemplos incluem, entre outros, as mutações nos genes que codificam o receptor de sensor do cálcio (BROWN, 2007), do receptor  do peptídeo atrial natriurético (OLNEY et al., 2006), e do receptor de melanocortina tipo 4 (FAROOQI et al., 2003). Já foi relatado que indivíduos adultos que transportam um único alelo mutante para o GHRHR têm baixo peso corporal devido a uma combinação de massa muscular reduzida e uma tendência à redução da massa gorda (kg), mas apresentam estatura adulta normal (PEREIRA et al., 2007). Os presentes dados mostram um fenótipo diferente de altura na idade adulta e senescência, durante o qual os indivíduos MUT/N são mais baixos do que os controles pareados por idade. Esta descoberta sugere que fatores genéticos podem contribuir para a perda de estatura com o envelhecimento, um fenômeno associado à sarcopenia, osteoporose e fragilidade, condições que são muito prevalentes e associados com os altos custos dos cuidados de saúde (GIOVANNINI et al., 2008). Portanto, a compreensão dos mecanismos de perda de altura em idosos é muito relevante em termos de saúde pública. A redução da altura dos indivíduos MUT/N idosos pode ser mediada por alterações em dois fatores interrelacionados, a composição corporal e a DMO. Recentemente, mostramos que os indivíduos MUT/MUT abaixo (EPITÁCIO- PEREIRA et al., 2013) e acima de 60 anos de idade (SOUZA et al., 2013) apresentam DMO volumétrica, corrigida para o tamanho das vertebras e com o tamanho do fêmur normal. Por outro lado, os indivíduos idosos com DIGH têm um número inferior de fraturas vertebrais do que indivíduos homozigotos normais, indicando um efeito benéfico sobre o fenótipo ósseo nos indivíduos MUT/MUT durante o envelhecimento. 45 Uma possível explicação é que esses indivíduos têm ossos bem adaptados à redução da massa muscular e força. A teoria mecanostática propõe que ossos se adaptam a força para manter a tensão das cargas fisiológicas exercidas pelo músculo próximo ao ponto de ação, dependendo da força necessária para suportar o estresse causado por cargas fisiológicas a um nível próximo de um ponto de ajuste, levando a uma relação entre a resistência óssea e, força muscular e o tamanho do osso (SCHOENAU, 2007). Assim, os indivíduos afetados MUT/MUT, que vivem com GH e IGF-I sérico muito baixo, podem ser bem adaptados ao tamanho do seu corpo, deixando seus ossos adaptados ao seu tamanho e forças de carga ao longo da vida (SOUZA et al., 2013). Nossa hipótese é que os indivíduos MUT/N se comportam como deficiência de GH de inicio na idade adulta, porque, tendo altura adulta normal e dimensões ósseas normais, com a redução do eixo GH-IGF-I com a idade exibem músculos mais fracos e declínio da função neuromusculoesquelética consequentemente maior redução estatural. Futuros estudos serão necessários para confirmação destes dados. A redução da altura encontrada no grupo jovem, 2,35 centímetros (não significativo) e no grupo de idosos 4,16 centímetros (p = 0,02) foi semelhante ao encontrado em duas coortes independentes na Escandinavia (Suécia e Finlândia) com haplótipos GHRHR peculiares (1,2 - 3,8 cm) (JOHANSSON et al., 2009). Estes indivíduos tinham variação da idade entre 15 e 87 anos, e a estratificação etária não foi fornecida. É possível que eles tivessem encontrado uma diferença mais acentuada se tivessem focado em indivíduos com idade maior que 60 anos. A sinalização reduzida no eixo GH/IGF-I retarda o envelhecimento e o aumento da longevidade em diferentes modelos animais, e muito recentemente, foi relatado que ratos que envelhecem lentamente com knockout no gene do receptor de hormônio de crescimento (GHR-KO) estão protegidos contra indução da fragilidade neuromusculoesquelética induzida pela idade (ARUM et al., 2013), um achado similar aos nossos indivíduos MUT/MUT com a mutação c.57 +1 G> A no GHRHR (SOUZA et al., 2013; AGUIAR-OLIVEIRA et al., 2010). No entanto, os indivíduos MUT/N parecem ser mais propensos a consequencias incapacitantes do envelhecimento do que os indivíduos N/N, talvez devido ao aparente agravamento da diminuição fisiológica do eixo GH/IGF-I, em pessoas com estatura normal na idade adulta. Embora as evidências clínicas 46 disponíveis não recomendem o uso de terapia de GH recombinante como antienvelhecimento, em muitos estudos sugerem o uso potencial da terapia de GH no tratamento da sarcopenia e fragilidade em idosos (BARTKE, 2009; SCHOENAU, 2007). É possível que os indivíduos MUT/N possam se beneficiar desta terapia. Por outro lado, o comportamento da pressão arterial foi semelhante em ambos os grupos de jovens e idosos, com o aumento esperado na pressão sanguínea com o envelhecimento em ambos os grupos, nos individuos MUT/N e nos N/N. O padrão de pressão sanguínea normal, combinada com a função de células beta normal, e aumento da sensibilidade à insulina (OLIVEIRA, et al., 2012) podem contribuir para a longevidade normal dos indivíduos MUT/N. Não encontramos diferenças entre os grupos MUT/N e N/N em nenhum dos grupos etários, na frequencia de fatores que poderiam levar a maior redução estatural no idoso, como tabagismo, alcoolismo e diabetes mellitus, todos autoreferenciados. A frequencia auto referida de diabetes no grupo idoso normal (15%) foi similar a dados brasileiros de 60 a 69 anos (MALERBI et al., 1992). Neste trabalho, infelizmente não realizamos a glicemia capilar. Assim, a avaliação de indivíduos idosos MUT/N não inclui a extensão da vida, mas a melhoria da sua qualidade de vida, se a redução da altura, de fato, puder antecipar a sarcopenia e fragilidade do idoso. No futuro, um painel de outros marcadores genéticos, incluindo haplótipos GHRHR ou mutações, pode ser útil para estabelecer medidas de prevenção ou tratamenento de tais condições. Uma limitação do nosso trabalho é que não avaliamos o estágio puberal, lactação e idade da menopausa em mulheres. Nos indivíduos MUT/MUT com a DIGH de Itabaianinha, a puberdade é atrasada, o início do climatério é precoce, o número de gestações é diminuído e o período de lactação é normal (MENEZES et al., 2008). Homens MUT/MUT apresentam aumento da testosterona total devido ao aumento da proteína transportadora dos hormônios sexuais (SHBG) com testosterona livre normal (MENEZES et al., 2013). O papel destes fatores na perda estatural dos indivíduos MUT/N idosos merecem novos estudos. Uma limitação adicional é que não utilizamos no questionário uso de drogas que possam interferir no metabolismo ósseo, conforme foi utilizado na avaliação da DMO dos indivíduos MUT/MUT jovens (EPITÁCIO-PEREIRA et al., 2013) e idosos (SOUZA et al., 2013) onde foi demonstrado em ambos os grupos uma DMO volumétrica, corrigida pelo tamanho ósseo, normal. 47 Finalmente, a redução estatural encontrada nos indivíduos idosos MUT/N demonstra que a expressão do fenótipo de uma mutação no gene do GHRHR pode ser manifesta mais obviamente nos estágios tardios da vida, o que pode traduzir a redução da atividade do eixo GH-IGF-I com o envelhecimento. A diminuição da massa muscular presente nos adultos jovens MUT/N, agravada pelo envelhecimento pode contribuir para esta diminuição da estatura. 48 7 CONCLUSÕES A heterozigose (MUT/N) para a mutação c.57+1G>A no GHRHR:  Foi associada a: o redução da estatura em indivíduos idosos. o redução do peso em indivíduos adultos jovens.  Não foi associada: o com efeito da idade no IMC. o com alterações da pressão arterial em nenhum dos grupos etários. o com alterações na longevidade. 49 REFERÊNCIAS ABELLAN van KAN, G. et al. The assessment of frailty in older adults. Clin Geriatr Med. v. 26, p.275-286, 2010. AGUIAR-OLIVEIRA, M.H. et al. Effect of Severe Growth Hormone (GH) Deficiency due to a a Mutation in the GH-Releasing Hormone receptor Insulin- Like Factors (IGf-I), IGF-Bending Proteins and ternary Complex Formation Throughout Life. J Clin Endocrinol Metab, v.84, p.4118-4125, 1999. AGUIAR-OLIVEIRA M.H. et al. Baixa Estatura em: Endocrinologia e Diabetes. 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Cláudio Dinart Deda Chagas, e suas Assessorias Jurídicas e de Comunicação, estamos apresentando a Vossa Excelência o delineamento da pesquisa “Longevidade nos indivíduos heterozigotos para a mutação de Itabaianinha”, cujo objetivo é verificar se indivíduos de estatura normal de Itabaianinha, que apresentam uma herança para o gene do nanismo (heterozigoto) são mais longevos dos que não apresentam nenhuma herança para o nanismo: 1- Será montada uma tenda (barraca) na praça central de Itabaianinha próximo ao Supermercado G. Barbosa que será identificada com faixa da Universidade Federal de Sergipe. Nesta barraca, uma equipe de aproximadamente 21 pessoas, formando 7 grupos de 3 pessoas, identificadas com camisas da UFS, acolherá os indivíduos interessados em participar da pesquisa, que são indivíduos de estatura normal com idade entre 20 a 40 anos e indivíduos maiores que 60 anos, num total aproximado de 700 indivíduos; 2- Cada grupo de três participantes irá medir altura, pesar, medir a pressão arterial e colher um esfregaço bucal de 100 indivíduos estimado em um tempo de 3 minutos para cada pessoa. O esfregaço bucal é indolor, será para verificar quantas pessoas de estatura normal do grupo apresentam uma herança (heterozigoto) ou nenhuma herança para a mutação que causa o nanismo em Itabaianinha; 3- Será feita uma divulgação por rádio e carro de som pelas ruas da cidade, bastante intensa, para explicar os objetivos da pesquisa e garantir o número de pessoas necessárias para a mesma. Caso Vossa Excelência concorde com esta pesquisa, solicitamos a fineza de enviar por fax e correio a declaração correspondente para ser anexada ao processo de submissão da pesquisa ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFS. Aguardamos a autorização para que possamos tomar as providências da logística, haja vista a proximidade das eleições. Atenciosamente, Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira Gestor do Projeto Ex.ma Srª Juíza Aline Cândido Costa Juíza da 10ª Zona Eleitoral 58 ANEXO 2 TERMO DE CONSENTIMENTO Local da pesquisa: Universidade Federal de Sergipe, Bairro Sanatório, S/N Aracaju, SE/ Brasil-49.060-100 Identificação do Paciente TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Título de projeto: Conseqüências de deficiência de hormônio de crescimento isolada vitalícia parte II (Termo de Consentimento dos Heterozigotos/Normais) Número da Aplicação: NA_00018533 Patrocinador: Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos da América Investigador principal: Roberto Salvatori, MD. Data: 26 de junho de 2008 1. O que você deve saber sobre este estudo:  Estão lhe pedindo que participe de um projeto de pesquisa.  Este termo de consentimento explica o projeto de pesquisa e sua participação no projeto.  Por favor, leia cuidadosamente e leve o tempo que você achar necessário.  Por favor, faça perguntas qualquer hora a por qualquer coisa que você não entenda.  Você é um voluntário. Se você participar do estudo, você pode mudar de idéia depois. Você pode desistir a qualquer momento. Não haverá nenhuma penalidade ou perda de benefícios se você decidir deixar o estudo.  Durante o estudo, nós lhe diremos qualquer informação nova que viermos a aprender e que poderia alterar seu desejo de continuar no estudo.  Durante este estudo, você não terá acesso a certas informações médicas e resultados de teste coletados para propósitos de estudo. Se uma emergência acontecer enquanto você estiver no estudo, as informações médicas precisas ou necessárias para seu tratamento serão disponíveis para seu médico. 59 Quando o estudo for completado, todas as informações em seu registro médico estarão disponíveis para você. 2. Por que esta pesquisa está sendo realizada? Esta pesquisa está sendo feita para determinar as conseqüências que a falta de hormônio de crescimento por muitos anos pode causar além da baixa estatura. Além disso, nós desejamos estudar se as pessoas de estatura normal, que portam o gene que causa baixa estatura em Itabaianinha têm alterações no corpo delas, comparados com pessoas que não portam este gene. Pessoas com baixa estatura devido à deficiência de hormônio de crescimento, seus parentes de estatura normal, e as pessoas normais que residem em Itabaianinha e municípios vizinhos podem se unir a este estudo. Um total de cerca de 930 pessoas entrará no estudo, embora lhes possam participar de diferentes testes. 3. O que acontecerá se você participar deste estudo? Se você concordar em participar deste estudo, nós lhe pediremos que faça uma ou mais das seguintes coisas abaixo: (somente as indicadas e não aquelas cruzadas): Para alguns voluntários só será pedido responder algumas perguntas sobre o estado de saúde deles e se eles têm parentesco com uns anões. Você será medido e será pesado, e se for selecionado para a pesquisa, nós coletaremos algumas células dentro de sua boca esfregando um cotonete de algodão suavemente na sua bochecha por aproximadamente 30 segundos. Isto nos permitirá obter seu DNA (material genético) para determinar se você pode transmitir a sua descendência, o gene alterado que causa a baixa estatura nos anões de Itabaianinha. Baseado no resultado do teste genético nós podemos lhe pedir que leve adiante uma segunda fase do estudo. Nós lhe pediremos que seja examinado em Itabaianinha ou na Universidade Federal de Sergipe em Aracaju. Nós organizaremos um transporte de carro à noite antes da prova ou mesmo no dia da prova para participantes serem deslocados para Aracaju, e transporte de retorno ao término de teste. Se você passar a noite, você ficará sem nenhum custo no Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe. Nós lhe pediremos que faça os testes indicados (nós colocaremos um “x” nos testes você não será solicitado para fazer):  ( )Será medida sua pressão sanguínea, estatura, dobras de pele  ( )Colher seis colheres de chá de sangue  ( )Nós lhe perguntaremos se você poderá estar grávida. Se você responder que sim será pedido para você colher uma amostra de sua urina, onde realizaremos um teste para saber se você está grávida  ( )Medir a força de seus ossos e a distribuição da gordura em seu corpo por um teste chamado “densitometria óssea por absorção de raios X de dupla energia (DXA)”  ( )Realize um teste para medir a quantidade de hormônio de crescimento que você produz durante a noite enquanto você dorme. Você será transportado para o Hospital Universitário em Aracaju, você receberá um jantar grátis. 60 Depois do jantar, uma veia será puncionada com um escalpe e uma agulha será colocada no antebraço. Será tirado então sangue, à noite com intervalo de vinte minutos a partir de 22:00 horas até às 8:00 horas da manhã seguinte, enquanto você dorme em uma cama de hospital. Um máximo de 4 colheres de sopa de sangue será coletado.  ( )Realize um teste de Tolerância a glicose para medir o aumento no sangue do nível de um hormônio chamado insulina, depois que nós injetarmos açúcar em sua veia. De manhã cedo, você será transportado para o Hospital Universitário em Aracaju. Você será solicitado para não comer nada antes da meia-noite, até o fim do teste. Serão puncionadas duas veias e colocados dois escalpes onde serão colocadas duas agulhas em seus antebraços. A metade de colher de chá de sangue será tirada novamente através do escalpe nos tempos 15, 10 e 1 minuto antes da administração do açúcar, e 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120 e 180 minutos depois da administração do açúcar. O total de sangue puncionado não será mais que 2 colheres de sopa. O único efeito negativo que a água e açúcar podem causar é um aumento ou diminuição dos níveis de açúcar no sangue.  ( )Voce realizará uma ultrasonografia abdominal total para verificar o nível de gordura na parede abdominal, através de um procedimento indolor próximo ao seu umbigo.  Uma parte de seu sangue será armazenada para possível repetição das provas ou estudos futuros.  Você só receberá os resultados do estudo se nós descobrirmos qualquer problema médico que pode precisar de tratamento.  Quanto tempo você estará no estudo? Você estará neste estudo por um tempo máximo de 24 horas. 4. Quais os riscos ou desconfortos do estudo?  A coleta do material bucal, o exame médico, medida das dobras da pele, pressão sanguínea e a ultra-sonografia não levam a nenhum risco.  A coleta de sangue, só leva ao risco de um pequeno sangramento, mas este procedimento será realizado por pessoal treinado, com material estéril para minimizar riscos.  Se for realizado o DXA (Densitometria óssea), este estudo de pesquisa incluirá exposição à radiação de radiografias ou raios gama. Esta exposição de radiação só é para propósitos de pesquisa e não é parte de seu tratamento médico. Radiografias e raios gama podem danificar células, mas em baixas doses, o corpo pode normalmente reverter este quadro. A exposição de radiação que você entrará em contato neste estudo de pesquisa é 0.02 rem (um rem é uma unidade de radiação absorvida). Isto é menos que o 0.3 rem que a pessoa comum nos Estados Unidos obtém cada ano de fontes naturais como o sol, espaço exterior, ar, comida, e terra. O risco da exposição de radiação neste estudo de pesquisa é muito pequeno. A exposição de radiação descrita aqui é somente a que você obterá neste estudo de pesquisa. Não inclui nenhuma exposição que você pode ter recebido ou receberá de outros testes médicos fora deste estudo que é uma parte de seu tratamento médico. Se você tem 61 perguntas sobre o total de radiação que você estará recebendo, você deverá perguntar para seu médico.  Se você realizar o teste de tolerância de glicose, há um risco pequeno que o açúcar em seu sangue possa ficar muito baixo. Se isto acontecer, você pode notar que as batidas do seu coração se tornarão mais rápida, você poderá começar a suar muito e perder um pouco a concentração. Se isto acontecer, você deverá nos informar imediatamente, e nós administraremos açúcar (Glicose) em sua veia, e o teste será parado, voltando tudo ao normal.  Você pode se sentir cansado ou entediado enquanto nós estivermos lhe fazendo perguntas ou você estiver completando questionários. Você não tem que responder qualquer pergunta você não queira responder.  Pode haver efeitos colaterais e desconfortos que ainda não são conhecidos. Durante este estudo, você será comunicado sobre qualquer fato novo que poderia afetar a sua continuidade neste estudo. 5. Há riscos relacionados à gravidez? Mulheres grávidas não podem fazer parte neste estudo. Se você for mulher e desconfie que pode estar grávida, você tem que ter um teste de gravidez. Os resultados deste teste deve ser negativos para que você continue no estudo. Se você ficar grávida (ou tiver suspeita de gravidez) antes do estudo ser completado, você tem que informar ao médico responsável pelo estudo. Porém, esta pesquisa pode lesar um embrião ou feto de modo que nós não sabemos atualmente. 6. Há benefícios de estar no estudo? Não há nenhum benefício direto a você de estar neste estudo. Voce poderá ajudar a outros no futuro. 7. Quais as opções se você não quiser fazer parte neste estudo? Você é livre para decidir se você quer participar deste estudo. Em nenhum momento será negado cuidado médico futuro a você porque se recusou a entrar neste estudo. Você não tem que participar deste estudo. Se você não participar, seu atendimento na Johns Hopkins University ou Universidade Federal de Sergipe não será afetado. 8. Você teria alguma despesa para participar deste estudo? Não. 9. Você será pago para participar deste estudo? Você não será pago para participar deste estudo. Se lhe pedirem para ir à Aracaju, serão providenciados transporte e alimentação gratuitamente. Voce poderá receber diária pelo dia de trabalho perdido. 10. Você pode deixar o estudo mais cedo?  Você pode concordar estar no estudo agora e depois mudar de idéia.  Se você desejar parar, por favor, nos fale imediatamente. 62  Você deixando o estudo mais cedo não terá seu tratamento médico interrompido.  Se você deixar o estudo mais cedo, o Johns Hopkins pode usar ou distribuir a informação sobre sua saúde que já tem mesmo que você não dê seguimento ao estudo. 11. O que nos levaria a retirá-lo mais cedo do estudo? Você pode ser levado para sair do estudo se:  Ficar no estudo for prejudicial a sua saúde.  Você precisa de tratamento não permitido no estudo.  Você não seguir as instruções.  Você ficar grávida.  O estudo for cancelado.  Pode haver outras razões que nós não sabemos neste momento para retirá-lo deste estudo. 12. Como sua privacidade será protegida? Algumas informações de sua saúde coletadas neste estudo serão enviadas para os Estados Unidos. Há uma lei nos Estados Unidos que protegem esta informação. A lei diz que informações médicas sobre você só podem ser usadas seguindo regras rígidas. Estamos lhe pedindo que nos deixe usar e distribuir detalhes sobre sua saúde como permitido por esta lei norte americana. Você não tem que concordar em permitir que façamos isto. Se você não estiver de acordo, você não entrará neste estudo. Se você concordar em nos deixar usar e distribuir informação sobre sua saúde você poderá mudar de ideia a qualquer momento. Caso você mude de ideia, por favor, nos fale e nos dê documento por escrito dizendo que mudou de ideia quanto a participar do estudo. Desta data em diante nós não coletaremos mais novas informações sobre sua saúde. Seu cancelamento não afetará as informações já coletadas anteriormente neste estudo. 13. O estudo exigirá que outros provedores de assistência médica compartilhem de suas informações de saúde com os pesquisadores deste estudo? Como parte deste estudo, os pesquisadores podem pedir para ver seus registros médicos de outros provedores de assistência médica. Nós pediremos para que este outro provedor de assistência médica nos forneça qualquer informação sobre seu estado de saúde e cuidados médicos. 14. Que custos de tratamento serão pagos se você ficar doente neste estudo? O governo federal e Johns Hopkins não têm programas para pagar se você for lesado ou tenha outras reações ruins por estar no estudo. Porém, os cuidados médicos no Johns Hopkins e a Universidade Federal de Sergipe estarão abertos a você como é a todas as pessoas doentes ou feridas. 63 - Se você tem plano médico de saúde: Serão faturados os custos para qualquer tratamento ou cuidado hospitalar que você receba como o resultado de um dano relacionado ao estudo. Qualquer valor que não for coberto pelo seu plano de saúde será faturado em seu nome. - Se você não tem plano médico de saúde: Será faturado em seu nome qualquer custo para qualquer tratamento ou cuidado hospitalar que você receba como o resultado de um dano relacionado ao estudo. 15. Que outras coisas você deveria saber sobre este estudo de pesquisa? A) O que é o Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) e como o protege? O CEP do Johns Hopkins Medicine e da Universidade Federal de Sergipe são compostos de :  Médicos  Enfermeiras  Conselho de Ética  Não cientistas  E pessoas da comunidade local. O CEP revisa estudos de pesquisa em seres humanos. Protege os direitos e bem-estar das pessoas que participam nesses estudos. Você pode contatar o CEP se você tiver perguntas sobre seus direitos como participante ou se você pensa que você não foi tratado devidamente. O número do telefone do CEP da Universidade Federal de Sergipe é (079) 2105-1805, falar com Maria do Carmo Queiroz Gouveia. Você também pode ligar para este número para retirar outras dúvidas sobre a pesquisa. B. O que você faz se tiver perguntas sobre o estudo? Ligue para o investigador, Dr. Manuel H. Aguiar-Oliveira no número 079 - 3227- 3026. Se você não puder localizar o investigador principal pode falar com outra pessoa, ligue para o Comitê de Ética em Pesquisa no Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe pelo telefone (79) 2105-1805. C. O que deveria fazer você se você se sentir doente como resultado de estar neste estudo? Ligue para Dr. Manuel H. Aguiar-Oliveira, pelo telefone (079) 3227-3026 ou pelo celular (79) 8803-9726, se você tiver um problema médico urgente relacionado à sua participação neste estudo. Ligue para o investigador local, Dr. Dr. Manuel Aguiar-Oliveira, ou telefone para (079) 3227-3026 ou o celular (79) 8826.6335 se você pensa que você está doente por causa deste estudo. O tratamento médico na Universidade Federal de Sergipe está aberto a você como a qualquer pessoa doente. D. O que acontece a Dados, Tecidos, Amostras de Sangue que são coletados no estudo? 64 A Universidade Johns Hopkins e a Universidade Federal de Sergipe são dedicadas à descoberta das causas e curas das doenças. As informações, tecidos, amostras de sangue coletadas de seu corpo durante este estudo são importantes para o mesmo e para pesquisas futuras. 16. O que significa sua assinatura neste termo de consentimento? Sua assinatura neste termo significa que:  Você entende a informação contida neste termo de consentimento  Você aceita as condições deste termo de consentimento  Você concorda em participar do estudo  Você não desistirá de nenhum direito legal por assinar este termo de consentimento. NÓS LHE DAREMOS UMA CÓPIA DESTE TERMO DE CONSENTIMENTO ASSINADA E DATADA. Este Termo de Consentimento foi aprovado em: 15/07/2008 até 14/07/2009. Não assine depois da data de vencimento de: 14/07/2009. PARA ADULTOS CAPAZES DE DAR CONSENTIMENTO: _______________________________________________________________ Assinatura do Participante Data PARA ADULTOS NÃO CAPAZES DE DAR CONSENTIMENTO: Assinatura do Representante/guardião/cuidador de saúde Data ASSINATURA(S): _______________________________________________________________ Assinatura de Pessoa que Obtém o Termo de Consentimento Data (Investigador pó pessoas designada pelo CEP) _______________________________________________________________ Assinatura de Testemunha para Consentir Procedimentos Data NOTA: UMA CÓPIA DO TERMO DE CONSENTIMENTO ASSINADA DEVE SER MANTIDA PELO INVESTIGADOR PRINCIPAL, UMA CÓPIA DEVE SER DADA AO PACIENTE E SE APROPRIADO, UMA CÓPIA DO TERMO DE 65 CONSENTIMENTO PODE SER COLOCADA NO PRONTUÁRIO MÉDICO DO PARTICIPANTE. PARA USO DE ESCRITÓRIO SÓ: ESTUDO APROVADO PARA MATRÍCULA DE: ( x ) Só Adultos ( ) Adultos e Crianças ( ) Só Crianças 66 ANEXO 3 Entrevista Nº ______________ Nome: ____________________________________________________________ Endereço: _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ Data de Nascimento: _______ / _______ / _____________ Idade: __________ anos Parentesco com Anão: Não ( ) Sim ( ) Qual: _____________________________ Fumante: Não ( ) Sim ( ) Quantos cigarros por dia: ________________ Diabético: Não ( ) Sim ( ) Não sabe: ( ) Indicadores do Consumo de Álcool: QUANTIDADE (SEMANAL) CLASSIFICAÇÃO MARCAR Nada Não Consome Até 3 doses (destilada) ou garrafas Consumo leve (fermentadas) De 3 a 7 doses (destilada) ou garrafas Consumo (fermentadas) moderado Acima de 7 doses (destilada) ou garrafas Consumo elevado (fermentadas) Peso: 1._________ Kg 2._________ Kg 3._________ Kg Altura: 1._________cm 2._________cm 3._________cm Pressão Arterial: 1.______ X ______mm/Hg 2.______ X ______mm/Hg 3.______ X ______mm/Hg Coleta do Swab Bucal: Sim ( ) Não ( ) Porque:_________________________ Entrevistado por: ____________________________ Equipe: ____________________________________ 67 ANEXO 4 Parecer do CEP e CONEP PARECER CONSUBSTANCIADO – CEP 043/2004 Título: Consequências da deficiência isolada e vitalícia do hormônio o crescimento. Finalidade: Projeto em parceria UFS-Jonh Hopkins. Pesquisadores responsáveis: Prof Dr Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira (graduado em Medicina, Mestre e Doutor em Clínica Médica/EndocrinologA mutation in GHRH receptor gene (GHRHR) (MUT/N) have similar height, but reduced weight and body mass index (BMI). However, only 10 % of the previously studied individuals were older than 60 years of age. We study here whether older MUT/N have an additional phenotype. Methods: In a cross sectional study we studied height, weight, systolic and diastolic blood pressure and BMI in two groups (young, 20-40 years of age) and old (60-80 years) of MUT/N individuals, and compared to a large number of individuals of normal genotype (N/N). In order to compare both genders, data were expressed as standard deviation scores (SDS). Results: SDS weight was lower [-0.13 (1.4) and -0.56 (1.8), p=0.03], and BMI had a trend toward reduction [0.08 (1.40) and 0.33 (1.4), p=0.060] in young MUT/N in comparison to young N/N. SDS height was lower in older MUT/N individual vs. N/N [-2.79 (1.1) and -2.37(1.0), p=0.04], corresponding to a reduction of 4.16 cm. Conclusions: These data confirm reduction in weight and BMI in young and show reduced stature in older MUT/N subjects, indicating different effects of heterozygosis through the ages. The reduction of muscle mass already present at young age, aggravated by aging may contribute to this reduction in height. Heterozygous GHRHR mutations may be a factor contributing to frailty in elderly. 80 Introduction Aging is associated with a progressive decline in muscle mass (MM) and function, resulting in loss of autonomy and decreased morbidity. A better understanding of the causes of MM decline and strategies to prevent it represents a public health priority. The correlation between the age-dependent decline of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) levels and changes in body composition, bone status and physical function have suggested that the GH/IGF-I axis decline may promote frailty by contributing to the reduction of MM and bone mineral density (BMD) [1, 2, 3]. Aging-related height reduction is caused by flattening of vertebral disks and bodies, and the accentuation of sagittal curvature of the spinal column associated to the reduction of both MM and BMD. Between 60 and 80 years of age, height reduction is nearly two cm per decade 4. This predicts disability, a late outcome of the frailty syndrome of the elderly 5. Homozygous GHRHR mutations are an important genetic cause of GH deficiency (GHD) resulting in short stature 6. Haplotype GHRHR variations are also important genetic factors for the height variation in normal populations 7. The c.57+1G>A GHRHR mutation, found in Itabaianinha, Brazil, is the one with the highest number of affected (MUT/MUT) individuals 8. The untreated adults present severe short stature, increase in fat mass percentage, and marked reduction in MM 9, but normal volumetric BMD both in individuals below 10 and above 60 years of age 11. While the consequences of bi-allelic GHRHR mutations are obvious, the heterozygous carriers do not appear readily distinguishable from homozygous normal (N/N) subjects. In a previous study, we have shown that MUT/N subjects have reduced weight, body mass index (BMI) and MM, but their adult stature is not significantly shorter than matched local controls 12. However, only 10 % of these individuals were ≥60 years of age. We hypothesized that the reduction of MM can worsen during senescence, leading to bone and postural changes and eventually height reduction. The main objective of this work was to assess the stature of older MUT/N individuals. Secondary aims were to evaluate the consequences of heterozygosity in the aging on weight, BMI and blood pressure. 81 Subjects and Methods A transversal study was carried out to compare height, body weight, BMI and, in two groups of genotyped normal-appearing subjects, young (20 to 40 yrs) and old (60 to 80 yrs) residing in Itabaianinha County, Sergipe Brazil, where the c.57+1G>A GHRHR mutation is highly prevalent. Advertising by broadcast and loud speakers, we invited people to volunteer on the day of the October 2008 municipal elections. A total of 843 normal appearing subjects volunteered, 500 young (255 females, 51%) and 343 old (164 females, 48%). They were all genotyped from buccal swabs as previously described 13. Height (cm) and body weight (kg) were measured with a portable stadiometer and a portable scale. Body mass index (BMI) was calculated using the formula: 2 weight in kg/height m . BMI was expressed in absolute values and standard deviation scores (SDS), calculated using the British 1990 Growth Reference Data, by using the site http://www.phsim.man.ac.uk/SDSCalculator/SDSCalculator.aspx. Blood pressure was the mean value of three measurements after 10 min in seated position. Data are expressed in mean (SD). Student‟s t test was used to compare the groups, and Fisher test was used to compare possible factors influencing the phenotype in each group, namely alcoholism, smoking and self-reported diagnosis of diabetes. Institutional Review Boards of both the Johns Hopkins University and the Federal University of Sergipe approved the protocol, and all subjects provided written informed consent. 82 Results Results are shown in table 1. There was no difference in the prevalence of the MUT/N genotype in the two groups: young 39/500 (7.8%) and older 24/343 (7.0%). SDS height was lower in older MUT/N individuals vs. N/N [-2.79 (1.1) and -2.37 (1.0), p=0.04] corresponding to a height reduction of 4.16 cm (p = 0.02). There was no difference in SDS height in young MUT/N [-1.4 (1.2) and -1.2 (1) vs. N/N], corresponding to 2.35 cm. Weight SDS was lower in younger (p = 0.03) MUT/N while difference in BMI did not reach statistical significance (p = 0.06). No difference was found in prevalence of alcoholism, smoking and self-reported diagnosis of diabetes between MUT/N and N/N in any age group. 83 Discussion While most autosomal recessive disease manifest a phenotype only when both alleles are defective, there are many examples of partial phenotype caused by a single allele defect “(“gene dosage effect”). Examples, among others, include mutations in genes encoding the calcium-sensing receptor 14, the natriuretic peptide receptor-B 15, and the melanocortin 4 receptor 16. Accordingly, we have previously reported that adult subjects carrying a single mutated GHRHR allele have low body weight due to a combination of reduced muscle mass and a trend toward a reduction in fat mass (Kg), but normal adult stature 12. Age-related height loss is a phenomenon associated with sarcopenia, osteoporosis and frailty, conditions that are very prevalent and of high health care cost 1. Therefore, understanding the mechanisms of height loss in the elderly is very relevant in terms of public health. These data of different height phenotype in young adulthood and senescence (when the MUT/N subjects appear shorter than controls) provides evidence that genetic factors may contribute to age-related loss of stature. The height reduction of elderly MUT/N can be mediated by changes in two interrelated factors, body composition and bone strength. We recently reported that both young 10 and old [11] GHD individual with bi-allelic GHRHR mutation have normal volumetric BMD, and the older GHD subjects actually have a lower number of vertebral fractures than in normal homozygous subjects, suggesting a beneficial on bone phenotype during aging. A possible explanation is that the GHD individuals have bones well adapted to their reduced muscle mass and strength. The mechanostat theory proposes that bones adapt depending on the strength required to withstand the stress caused by physiological loads at a level close to a set point, leading to a relationship between bone strength, and muscle strength and bone size 17. Thus, the short GHD individuals may be well adjusted to the size of their body, with bones that throughout life are well adapted to their reduced loading forces 11. We do not have data on GH secretion in MUT/N, but we hypothesize that the MUT/N old phenotype resembles adult onset GH deficiency, who have an increased risk of fractures 18. In this condition, subjects with normal adult height and bone dimensions, and with decline in the GH/ IGF-I axis, may have weaker muscles and neuro-muscular function decline. As they cannot revert into a smaller size, their body and habitual 84 loading forces are excessive for their weakened musculoskeletal system [19]. Obviously, further studies need to confirm this hypothesis. The height reductions found in the young group, 2.35 cm (not significant) and in the elderly group 4.16 cm (p = 0.02) are of a degree similar to that found in two independent Scandinavian cohorts with specific GHRHR haplotypes (1.2 to 3.8 cm) 7. The subjects in that study were of broad age (between 15 and 87 years), and no age stratification was provided. It is possible that a more marked difference would have been found if they had focused on individuals > 60 yrs. As several families have been reported with GHD due to compound heterozygosity for two distinct GHRHR mutations [6], it is conceivable that these defective GHRHR alleles are rather common in the general population. It is therefore conceivable that in the future a panel of genetic markers, including GHRHR haplotypes or mutations, may be useful to stratify risk of height loss or other aging- associated phenomena. Reduced signaling in the GH/IGF-I slows down the aging and increased longevity in different animal models, and very recently it was reported that the GH receptor gene-disrupted (GHR-KO) mouse is protected from age-induced neuromusculoskeletal frailty [20], a finding similar to our MUT/MUT individuals 11, 13. However, MUT/N individuals seem to be more prone to the consequences of aging than N/N, possibly due to more marked worsening of the physiological decrease of GH/IGF–I. Although present clinical evidence does not recommend the use of recombinant GH therapy as anti-aging, some investigators have suggested a potential utility of GH therapy in the treatment of sarcopenia and frailty in the elderly [2, 21]. It is possible that older MUT/N individuals could benefit from this therapy. Contrarily to stature, blood pressure was similar in both young and elderly groups, with the expected increase in blood pressure with aging in both MUT/N and N/N group. The normal blood pressure pattern, combined with normal beta cell function and increased insulin sensitivity [22, 23] may contribute to the normal longevity of MUT/N individuals [13]. In conclusion, the reduced height found in the elderly MUT/N shows that the phenotypic expression of heterozygosity for a GHRHR mutation can be seen more clearly in later stages of life, possibly reflecting the reduced activity of the GH-IGF-I axis in aging. The decreased muscle mass already present in young MUT/N adults, exacerbated by aging may contribute to this decrease in height. 85 Acknowledgements We thank the Tribunal Electoral de Sergipe and the Catholic Roman and First Baptist churches in Itabaianinha for allowing us to perform this work. Ethical standards Institutional Review Boards of both the Johns Hopkins University and the Federal University of Sergipe approved the protocol. Written informed consent was obtained from all subjects. Experiments comply with the current laws of Brazil and USA. Conflict of interest The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of the research reported. 86 References 1. S. 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Age 20 - 40 years Age 60 - 80 years N/N MUT/N P value N/N MUT/N P value N=461 N=39 N=319 N=24 Height (cm) 163.1 (8.7) 160.8 (9.4) 0.16 155.9 (8.7) 151.8 (8.0) 0.02 SDS Height -1.2 (1) -1.4 (1.2) 0.30 -2.4 (1) -2.8 (1.1) 0.04 Weight (Kg) 65.3 (12.8) 62.5 (20.3) 0.49 62.8 (12.4) 59.8 (13.0) 0.25 SDS Weight -0.1 (1.4) -0.5 (1.8) 0.03 -0.6 (1.6) -0.8 (1.9) 0.52 2 BMI (Kg/m ) 24.4 (4.4) 24.2 (6.5) 0.24 25.8 (4.5) 26.2 (6.1) 0.67 SDS BMI 0.3 (1.4) 0.1 (1.4) 0.06 0.7 (1.4) 0.7 (1.4) 0.96 SBP (mmHg) 122.5 (18) 122.2 (16.7) 0.75 143.9 (22.2) 147.1 (23.2) 0.65 DBP (mmHg) 79.6 (13.3) 78.5 (10.4) 0.49 84.8 (13.9) 86.5 (12.4) 0.46 Tobacco Use no. (%) Non-smoker 363 (84) 17 (85) 0.17 230 (74) 12 (75) 0.87 Current Smoker 66 (15) 2 (10) 68 (22) 4 (25) Former Smoker 3 (1) 1 (5) 11 (4) 0 (0) Unanswered 29 19 10 8 Alcohol Use – no. (%) No alcohol 188 (44) 13 (65) 0.15 233 (75) 11 (73) 0.15 Mild 136 (32) 2 (10) 55 (18) 1 (7) Moderate 61 (14) 2 (10) 12 (4) 2 (13) High 40 (9) 3 (15) 5 (2) 1 (7) Former user 5 (1) 0 (0) 5 (2) 0 (0) Unanswered 31 19 9 9 Diabetes – no. (%) Not diabetic 441 (99) 34 (100) > 0.99 262 (85) 23 (96) 0.23 Diabetic 5 (1) 0 (0) 48 (15) 1 (4) Unanswered 15 5 9 0 91 APÊNDICE 3 92 93 94 95 96 97 APÊNCICE 4 98 99 100 101 102